[發(fā)明專利]不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110281129.0
• 申請(qǐng)日: 2011-09-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102367475A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 麻麗丹;于曉婕;王殿夫;于杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 麻麗丹;于曉婕;王殿夫
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 劉曉琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)水體和食品樣品中O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧菌和非O1/非O139群霍亂弧菌的試劑盒及方法。尤其涉及檢測(cè)所使用的特異性引物和探針序列。

背景技術(shù)

對(duì)霍亂疫區(qū)的外環(huán)境水體和食品樣品進(jìn)行霍亂弧菌監(jiān)測(cè)是霍亂防治工作的重要組成部分，監(jiān)測(cè)結(jié)果可對(duì)評(píng)價(jià)外環(huán)境水體中霍亂弧菌污染狀況、制訂霍亂防控策略提供科學(xué)依據(jù)，另外，對(duì)環(huán)境水體和食品樣品中的霍亂弧菌的監(jiān)測(cè)可作為霍亂流行的預(yù)警指標(biāo)。水體和食品樣品中的霍亂弧菌檢測(cè)通常是采用傳統(tǒng)的堿性蛋白胨增菌法，國(guó)家衛(wèi)生部編制的《霍亂防治手冊(cè)》及GB15984-1995《霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》首選方法也是此法。但在霍亂的非流行期，霍亂弧菌在外環(huán)境水體中自然生存狀態(tài)下菌量較少，同時(shí)由于外環(huán)境水體中存在大量其它雜菌，會(huì)對(duì)霍亂弧菌的分離鑒定產(chǎn)生干擾；并且水體中含有大量的有機(jī)物，常規(guī)法在增菌過(guò)程中有機(jī)物在微生物的作用下pH值迅速降低，嚴(yán)重抑制著霍亂弧菌的生長(zhǎng)，致使霍亂弧菌不易檢出而容易出現(xiàn)假陰性，造成在疫情監(jiān)測(cè)和調(diào)查中產(chǎn)生誤差，不適應(yīng)烈性傳染病的監(jiān)測(cè)需要。

因此，有必要研究一種方法，可同時(shí)針對(duì)不同血清型霍亂弧菌進(jìn)行快速且大批量檢測(cè)。在PCR反應(yīng)中使用一對(duì)以上的引物和不同熒光標(biāo)記物的探針進(jìn)行檢測(cè)的多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)在同一樣品的多種致病菌檢測(cè)中已經(jīng)有一定的應(yīng)用，但現(xiàn)有技術(shù)中還未見(jiàn)有針對(duì)霍亂弧菌不同血清型檢測(cè)的多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)；另外，Taqman?MGB探針是在Taqman探針基礎(chǔ)上提出的一種新型分子探針，它的熒光淬滅基團(tuán)是一種基本無(wú)熒光本底的小溝結(jié)合物，降低了本底，可以用較短的探針達(dá)到更好地分辨效果，增加了對(duì)指定目標(biāo)檢測(cè)的可靠性，可以更好的實(shí)現(xiàn)多重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。本發(fā)明人旨在建立利用多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)水體和食品樣品中不同血清型霍亂弧菌的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

本發(fā)明所述的不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測(cè)試劑盒中包括如下引物和探針：

①霍亂弧菌的O1群rfb基因的檢測(cè)引物和探針序列：

正向引物(SEQ?ID?NO.1)：5′-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3′，

反向引物(SEQ?ID?NO.2)：5′-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3′，

探針(SEQ?ID?NO.3)：5′FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB)-3′；

②霍亂弧菌的hlyA基因的檢測(cè)引物和探針序列：

正向引物(SEQ?ID?NO.4)：5′-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3′，

反向引物(SEQ?ID?NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探針(SEQ?ID?NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3′；

③霍亂弧菌的O139群rfb基因的檢測(cè)引物和探針序列：

正向引物(SEQ?ID?NO.7)：5′-AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3′，

反向引物(SEQ?ID?NO.8)：5′-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3′，

探針(SEQ?ID?NO.9)：5′VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)-3′。

所述的試劑盒中還包括其它用于PCR擴(kuò)增的試劑，這些試劑本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)選擇使用。

本發(fā)明另一方面的目的在于提供一種不同血清型霍亂弧菌的m-PCR檢測(cè)方法，主要針對(duì)食品和水體中存在的霍亂弧菌。所述方法使用上文所述本發(fā)明的檢測(cè)不同血清型霍亂弧菌的試劑盒，是利用特異性引物和探針進(jìn)行多重PCR(m-PCR)擴(kuò)增，并以擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判定的方法。

所述方法包括如下步驟：

①提取待測(cè)樣品DNA，得到模板DNA溶液；

②反應(yīng)體系：總體積20ul，包括步驟①制得的模板DNA溶液2μl，2×PCR?TaqmanGEx酶預(yù)混液10μl，霍亂弧菌的O1群rfb基因上下游引物各0.8μL、探針0.4μL，霍亂弧菌的hlyA基因上下游引物各0.4μL、探針0.2μL，霍亂弧菌的O139群rfb基因上下游引物各0.4μL、探針0.2μL、滅菌超純水4.0μl；其中各引物和探針的濃度均為10μM；