[發明專利]從分化細胞制備自體造血干細胞的方法

無效

• 申請號: 201110281117.8
• 申請日: 2011-09-21
• 公開（公告）號: CN102321571A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 王躍嗣
• 申請（專利權）人: 王躍嗣
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N15/07
• 代理公司: 煙臺信合專利代理有限公司 37102
• 代理人: 張露晶

技術領域

?本發明涉及一種從分化細胞制備自體造血干細胞的方法，屬基因技術領域。

背景技術

干細胞是一種功能未特定的細胞，具有兩個特性：即具有無限的自我更新能力，能夠分化為一種以上的高度分化子細胞的能力，實際上包括了從胚胎發育到成人生長發育過程中各種未分化成熟細胞。既包括生命起源細胞，組織器官發育的原始細胞，也包括成體組織更新換代、損傷修復的種子細胞。因此，干細胞具有多種潛在的用途，包括細胞治療、用于制造可供移植的組織和器官、基因治療以及藥物篩選等。

成體干細胞是一類功能未特定分化的或未分化的細胞，其存在于多種成體組織中。成體干細胞能夠分化成為所屬組織中的幾乎所有細胞類型，而且可以跨胚層分化，具有多向分化能力。成體干細胞常見于骨髓、血液、腦、角膜、牙齒、肝臟、皮膚等。

胎盤中具有大量造血干細胞，可以用來移植給患有嚴重白血病等血液系統疾病的病人來治療血液疾病，具有非常重要的臨床應用。但具有兩個缺點，一是細胞量相對較少，兒童用量可以，但對成人使用則量嚴重不足，不能用于成人移植；第二，最重要的是，胎盤造血干細胞具有自己的白細胞抗原（HLA），雖然免疫原性較小，但也存在免疫抑制反應。既然造血干細胞具有重要的用途，能不能構建具有自己的HLA的患者的造血干細胞，解決免疫抑制危險呢？因此存在制備自體造血干細胞的需求。

發明內容

本發明基于這樣的認識，即已有的胚胎干細胞的胞質能使分化的細胞發生重編程，成為多能干細胞，那么多能干細胞的胞質是不是也具有這樣的功能呢？而且，如果發生重編程，得到的雜種細胞是否與供者細胞具有相同的HLA，即具有免疫相容性，新產生的多能干細胞能否分化形成與所供細胞來源相同的白細胞抗原，由此可以避免在患者體內產生的免疫排斥反應。因此，本發明旨在解決上面提到的解決免疫排斥反應和干細胞來源問題，提供一種從分化細胞制備自體造血干細胞的方法。

本發明的技術方案是：一種從分化細胞制備自體造血干細胞的方法，包括以下步驟：

a、從胎盤中獲取造血干細胞；

b、將造血干細胞去核，獲取胞質；

c、將所獲胞質與分化細胞進行融合，以產生胞質雜種細胞；

d、培養所述胞質雜種細胞以產生造血干細胞。

另外，在d步驟前，還可以添加將所述胞質雜種細胞轉移至飼養層上擴增的步驟，所述的飼養層可以為胎盤貼壁細胞飼養層。

上述分化細胞包括皮膚成纖維細胞、毛囊細胞、毛囊干細胞等分化細胞。

本發明利用胞質互作原理，將臍血造血干細胞分離純化，密度梯度離心去核，造血干細胞胞質可以和成纖維細胞核相互作用，對細胞核重編程，產生融合造血干細胞，可以構建與患者HLA配型一致的融合雜合造血干細胞，經過篩選擴增，可以作為臨床移植造血干細胞的一個新的來源，其來源廣泛，并且沒有免疫排斥反應。本發明方法簡單，經濟方便，為白血病等疾病的治療提供了新的基礎資料和理論依據，更為臨床產生患者自體造血干細胞提供了一個新的方式。

下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細地說明，雖然本發明允許有多種不同形式的實施方式，但本發明將詳細說明至少一種實施方式和其他可能的替代方法，同時，本發明公開的內容應該被認為是在舉例說明本發明的方法和原則，而不是將本發明限制在所描述的具體實施方式中。

附圖說明

圖1是融合后造血干細胞CD34⁺細胞體外培養的各階段形態學特征。

具體實施方式

本發明產生自體造血干細胞的主要思想是：將來自胎盤的造血干細胞與分化細胞融合而產生胞質雜種細胞，其是多能干細胞，所產生的胞質雜種細胞表達供體細胞來源的主要組織相容性抗原（MHC），特別是表達與所述細胞相同的白細胞抗原（HLA）。

本發明使用的分化細胞可以是皮膚成纖維細胞、毛囊細胞、毛囊干細胞等，而不使用淋巴細胞。這是由于皮膚成纖維細胞相對其他細胞來源來說比較簡單，傷害性較小。而且胞質較少，因此使用皮膚成纖維細胞與造血干細胞的胞質進行融合是比較合適的。

????一、從臍帶血和胎盤中獲取造血干細胞

1、臍帶血（UCB）的采集

用60ml的注射器吸入2ml肝素，裝上16口徑的針頭，從臍帶靜脈中收集UCB，立即顛倒幾次進行混勻，防止血液凝固。

2、MNC的制備和培養

（1）向每個50ml離心管中加入15mlUCB，用20mlPBS進行稀釋。

（2）加入15mlFicoll，用導管將Ficoll置于UCB的底部，使之形成一個清晰的界面。