[發明專利]白沙蒿Δ12脂肪酸脫氫酶(As FAD2)基因及用途

有效

• 申請號: 201110281024.5
• 申請日: 2011-09-10
• 公開（公告）號: CN102533804A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 張麗靜;傅華;劉永紅
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10;C12N15/11;A01H5/00
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及一種新的基因序列，以及這種基因序列的制備方法和用途，確切講本發明涉及白沙蒿Δ12脂肪酸脫氫酶(As?FAD2)及其制備與用途。?

背景技術

Δ12脂肪酸脫氫酶(FAD2)是植物控制亞油酸合成的關鍵酶，利用相關植物的FAD2基因進行基因重組，所得到的轉基因植物或者植物以外其它轉基因生物將在脂質代謝、細胞識別、免疫反應、耐寒等諸多方面將有新的表現。例如：中國發明專利申請200580048074.1公開的編碼植物脂肪酸去飽和酶基因的核酸分子及其使用方法中涉及了植物中種子貯存化合物的存在相關的蛋白質的編碼核酸序列，涉及到在轉基因植物中的用途。如：脂質代謝相關化合物的操作方法，以及在植物和種子中提高油水平和改變脂肪酸組成的方法；以及應用這些新的植物多肽刺激植物生長和/或提高產率和/或種子貯存，等內容。中國發明專利申請200810186867.5公開的雙途徑基因表達同步抑制獲得高油酸低芥酸油菜的方法中介紹了利用改良的RNA干擾技術和基因工程手段，對油酸轉化為其它脂肪酸的兩條代謝途徑①和②上的基因表達同時進行干擾沉默，最大限度阻止油酸轉化為其它類型的脂肪酸，實現大幅度提高油酸含量和大幅度降低芥酸含量的方法。?

在GenBank中已公布花生、蕓薹、擬南芥、歐芹、茄和棉花等植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列。?

發明內容

本發明提供一種取自沙生植物-白沙蒿的FAD2基因，以及這種基因的制備方法及用途。?

本發明所述的白沙蒿FAD2基因序列為基因序列表中的SEQ?1。?

本發明所涉及的白沙蒿FAD2基因制備方法是：首先提取白沙蒿的RNA，再反轉錄為cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列進行同源性分析，根據保守區設計合成一對簡并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA為模板擴增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根據測序得到的FAD2基因核心片段序列分別設計白沙蒿FAD2基因特異引物5’端外側引物P3和巢式引物P4，分別與GeneRacer^TM試劑盒中自帶的5’P和5’NP?配對，以白沙蒿cDNA為模板，進行5’外側和巢式PCR擴增反應，得到5’末端核苷酸序列；同樣根據測序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分別設計白沙蒿FAD2基因特異引物3’端外側引物P5和巢式引物P6，分別與GeneRacer^TM試劑盒中自帶的3’P和3’NP配對，以白沙蒿cDNA為模板，進行3’外側和巢式PCR擴增，得到3’末端核苷酸序列；根據已克隆到的白沙蒿AsFAD25’和3’末端核苷酸序列，設計與該基因編碼區兩端特異的引物P7、P8，擴增得到白沙蒿FAD2基因的全長翻譯區核苷酸序列。在引物的5’端分別加入BamHI和SacI酶切位點序列，便于后期的基因編碼區與植物表達載體重組。?

實驗表明，構建AsFAD2的表達載體，轉染煙草后得到的轉基因植物葉片中亞油酸含量提高了3.57倍；在冷凍脅迫(2℃)進行的12小時期間，轉基因植物抗凍性明顯升高。?

據報道，不飽和脂肪酸的增加與植物抗生物(病原體、植物病原體互做等)和非生物脅迫(低溫、干旱、鹽、重金屬等)密切相關，參見：Robert?G.Upchurch“Fatty?acid?unsaturation，mobilization，and?regulation?in?the?response?of?plants?to?stress”Biotechnol?Lett(2008)30：967-977，因此，白沙蒿Δ-12脂肪酸脫氫酶基因有可能在這些過程中發揮作用。?

本發明具體采用的相關引物均由大連寶生物合成(寶生物工程有限公司，遼寧省大連市經濟技術開發區東北二街19號，郵編116600)，序列如下：?

P1：5’-AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3’，?

P2：5’-TKCCAYCRYIKSATWATRWKG-3’；?

P3為：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，?

P4為：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，?

5’P為：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，?

5’NP為：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；?

P5為：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，?