[發(fā)明專利]一種測(cè)定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110279487.8
• 申請(qǐng)日: 2011-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN102435727A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王利兵;胥傳來(lái);許宙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王利兵;胥傳來(lái);許宙
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

1.一種測(cè)定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于包括：水溶性螺旋聚合物的制備，半抗原修飾螺旋聚合物，金納米粒子偶聯(lián)抗體，新霉素傳感器的建立；具體步驟為：

（1）水溶性螺旋聚合物聚4-異氰基苯甲酸的制備

a、4-氨基苯甲酸甲酯的制備

b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制備

c、4-異氰基苯甲酸甲酯的制備

d、4-異氰基苯甲酸鈉的制備

e、聚4-異氰基苯甲酸鈉的制備

f、聚4-異氰基苯甲酸的制備

（2）半抗原修飾螺旋聚合物

（3）金納米粒子偶聯(lián)抗體

（4）新霉素傳感器的建立。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于：

（1）水溶性螺旋聚合物的制備

a、4-氨基苯甲酸甲酯的制備

2.6g?4-溴苯甲酸甲酯，113mg三丁基膦，321g雙(二亞芐基丙酮)鈀和3.75g雙-(三甲基硅基)胺鋰，放入50mL錐形瓶中，氬氣保護(hù)，加入26mL無(wú)水甲苯，橡膠塞密封錐形瓶，室溫下攪拌混合物，薄層色譜監(jiān)控反應(yīng)物，反應(yīng)兩天后，粗產(chǎn)物加入100mL乙醚稀釋，同時(shí)加入少量鹽酸，再加入300mL乙醚攪拌，4-氨基苯甲酸甲酯沉淀用乙醚洗滌，空氣中干燥后，再加入100mL?2M?NaOH溶液，并將混合物用100mL?CH₂Cl₂萃取，再向其中加入100mL飽和NH₄Cl溶液稀釋，將有機(jī)層用MgSO₄除水，再蒸干；粗產(chǎn)物用硅膠色譜純化，正己烷:乙酸乙酯體積比1:4的混合溶劑作洗脫液，最終得4-氨基苯甲酸甲酯；

b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制備

氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下將1.02g?4-氨基苯甲酸甲酯溶于3.4mL甲酸和8.51mL乙酸，在50℃下攪拌2h后，反應(yīng)物減壓干燥；產(chǎn)物用乙醚和正己烷洗滌，室溫下真空干燥過(guò)夜，得產(chǎn)物4-甲酸氨苯甲酸甲酯；

c、4-異氰基苯甲酸甲酯的制備

1.07g?4-甲酸氨苯甲酸甲酯，1mL無(wú)水三乙胺和3mL無(wú)水CH₂Cl₂置入帶有回流冷凝氣的三口燒瓶中，溫度維持在-30℃，0.2mL氯甲酸三氯甲酯溶于CH₂Cl₂加入反應(yīng)物中，0℃攪拌反應(yīng)1h，再在20℃反應(yīng)0.5h，加入50mL?質(zhì)量濃度7.5%碳酸氫鉀水溶液，將有機(jī)層用MgSO₄除水，再蒸干，粗產(chǎn)物用硅膠色譜純化，正己烷:乙酸乙酯體積比3:1作洗脫液，最終得4-異氰基苯甲酸甲酯；

d、4-異氰基苯甲酸鈉的制備

4-異氰基苯甲酸甲酯棕色固體0.654g溶解于1.8mL乙醇，再加入8.3mL?1M?NaOH溶液，混合物于氮?dú)獗Ｗo(hù)下0℃反應(yīng)1.5h，收集沉淀，乙醇洗滌，室溫下真空干燥過(guò)夜，最終得4-異氰基苯甲酸鈉；

e、聚4-異氰基苯甲酸鈉的制備

4-異氰基苯甲酸鈉1.00g置于反應(yīng)瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入11.8mL超純水、0.2mL?0.3M?NiCl₂·6H₂O，過(guò)夜反應(yīng)，沉淀用甲醇洗滌，真空干燥，得聚4-異氰基苯甲酸鈉；

f、聚4-異氰基苯甲酸的制備

0.9g聚4-異氰基苯甲酸鈉置于1M?HCl溶液中，得聚4-異氰基苯甲酸；

（2）半抗原修飾螺旋聚合物

1μL?碳化二亞胺EDC和2.4mg?N-羥基硫代琥珀酰亞胺sulfo-NHS加入到0.5mL?100?mg/mL的步驟（1）合成的聚4-異氰基苯甲酸水溶液中，反應(yīng)10-15?min活化，活化后的聚4-異氰基苯甲酸加入1mg新霉素，室溫反應(yīng)4h，透析除去未反應(yīng)的藥物小分子；得聚4-異氰基苯甲酸-新霉素復(fù)合物，即為半抗原修飾螺旋聚合物；

（3）金納米粒子偶聯(lián)抗體

10mL?20nM?8nm金納米粒子溶液，加入200μL?100μg/mL新霉素抗體，0.1M?K₂CO₃調(diào)節(jié)pH值為8.0，反應(yīng)1h；得金納米粒子偶聯(lián)抗體；

（4）新霉素傳感器的建立

1mL?20nM步驟（3）合成的金納米粒子偶聯(lián)抗體加10μL?100mg/mL步驟（2）合成的半抗原修飾螺旋聚合物，加入0.1-100ng/mL?新霉素標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)1h后，取組裝好的體系100μL于比色皿中，用水做空白對(duì)照，圓二色譜儀掃描波長(zhǎng)200-800nm?CD值。