[發明專利]一類細胞色素P450 3A4酶的特異性探針底物及其應用

有效

• 申請號: 201110277661.5
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102993263A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 楊凌;葛廣波;寧靜;吳敬敬;杜遜甫
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07J71/00
• 分類號: C07J71/00;C12Q1/26
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術領域

本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一類蟾蜍甾烯類化合物，如華蟾毒精、去乙酰華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈三個化合物及其結構類似物，其可作為細胞色素P450?3A4酶的特異性探針底物，用于不同來源生物樣本中細胞色素P450?3A4酶活的定量測定，以期實現對重要藥物代謝酶CYP?3A4處置藥物能力的評估。

背景技術

細胞色素P450酶（Cytochrome?P450,?CYP）超家族包含了機體內最重要的藥物代謝酶，參與約80%以上上市藥物的代謝，其中經細胞色素P4503A亞家族代謝的藥物約占50%。人體中表達了四種細胞色素P4503A亞型，分別為細胞色素P4503A4、P4503A5、P4503A7以及P4503A43。細胞色素P4503A4占總細胞色素P450酶含量的30～60％（Annu?Rev?Pharmacol?Toxicol?1999，39:1–17），在肝、腸、腎、脾、心臟各器官中有非常廣泛的分布，相比于人群中表達量低、表達頻率低的細胞色素P4503A5，一直被認為是成年個體表達的最主要的細胞色素P4503A單酶。一般來講，CYP3A亞家族中的各種亞型的酶都具有相似的底物具體性，也就是說，某一底物若被CYP3A4催化代謝，那么這一底物就極可能同時被CYP3A5及其它CYP3A家族的酶代謝。目前，已經發現的或已在體外、體內研究中廣泛應用的CYP3A亞家族探針底物，如咪達唑侖（midazolam）、尼非地平（nifedipine）、睪酮（testosterone）、雌二醇（estradiol）等，都同時是CYP3A4和CYP3A5的特異性底物。相對應的，利用這些探針底物對細胞色素P450酶進行的評估結果反映的就是細胞色素P4503A亞家族各單酶的催化能力的總和。然而，近期的研究發現，細胞色素P4503A5在某些個體中顯現的催化能力甚至與細胞色素P4503A4的催化能力相當（Drug?Metab?Dispos?2002，30:883-91），此時利用目前已有的探針則會混淆細胞色素P4503A4和3A5的催化能力，從而無法清晰地分析細胞色素P4503A4對某藥物的代謝清除能力。

此外，在鼠（細胞色素P4503A1﹑細胞色素P4503A2）、狗（細胞色素P4503A12、細胞色素P4503A26），兔（細胞色素P4503A6），豬（細胞色素P4503A29），猴（細胞色素P4503A64）等哺乳動物體內，也高表達細胞色素P4503A4的同功酶，這些酶之間的底物有非常廣泛的重疊性。利用細胞色素P4503A4的高特異性探針也可在體外活性測定方面實現對不同種屬中細胞色素P4503A4的同功酶的評價與考察。

目前，細胞色素P4503A4酶活性的體外評價體系主要包括重組單酶﹑哺乳動物的亞細胞組分﹑新鮮提取的肝細胞﹑原代培養肝細胞、肝切片﹑肝灌流等（Toxicology?in?Vitro?2006，135–153），其中已經商品化的重組細胞色素P4503A4單酶主要來自于細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌建立的克隆表達體系，而亞細胞組分主要包括微粒體、細胞胞漿及S9成分。采用這些標準化的評價體系，結合相應的輔因子（如：NADPH等）和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清除或產物生成速率，對上述各種體系中表達的細胞色素P4503A4酶活性進行表征。余琛（CN101308119）等人還利用肝微量穿刺法構建了新型微量肝組織體外孵育體系，并采用咪達唑侖作為探針底物，通過測定咪達唑侖與其代謝產物1－羥基咪達唑侖含量的比值，來作為細胞色素P4503A體外活性評價指標。

綜上所述，評估細胞色素P4503A4代謝酶活性，關鍵在于選擇高特異性的探針藥物。

發明內容

本發明涉及一類蟾蜍甾烯類化合物以及其在檢測細胞色素P4503A4酶活性中的用途及其檢測方法，蟾蜍甾烯類化合物（bufadienolides）是一類甾體類成分，該系列化合物具有圖1所示的基本結構，它可作為細胞色素P450?3A4酶的高特異性探針底物，用于定量測定不同來源生物樣本中CYP3A4酶活。與目前已報道的細胞色素P4503A探針/標準底物不同，蟾蜍甾烯類系列化合物中的單體具有高特異性表征細胞色素P4503A4酶活性的能力，其并不被CYP3A5催化。因此能夠高特異性的評價機體或組織中CYP3A4酶對藥物的處置能力，對體外藥物代謝研究具有重要意義。