[發明專利]小分子脂肪酸化學修飾提高氯過氧化物酶催化活性的方法

無效

• 申請號: 201110276948.6
• 申請日: 2011-09-16
• 公開（公告）號: CN102352348A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 蔣育澄;李超男;胡滿成;翟全國;李淑妮
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術領域

本發明屬于酶工程技術領域，具體涉及一種通過小分子化學修飾提高酶的催化活性的方法。

背景技術

酶催化反應由于其具有條件溫和、高效定向、環境友好等特點，如今已被廣泛應用于有機合成、藥物制備等領域，被視為今后大宗化學品綠色合成的重要手段，對實現可持續發展戰略具有重要意義。

氯過氧化物酶(CPO)是自海洋真菌Caldariomyces?fumago中分離出的一種血紅素糖蛋白酶，CPO因其獨特的活性位點結構而兼具過氧化物酶、過氧化氫酶以及細胞色素P-450的催化功能，目前被認為是已知的血紅素過氧化物酶家族中應用最廣泛的酶，并且具有廣泛的底物適應性，因此CPO在環境生物催化、醫藥工業和現代合成化學中具有很大的應用潛力。

如何改善天然酶的催化活性，提高酶促反應的效率，一直以來是人們堅持不懈的努力目標。然而由于酶蛋白是分子量很大的生物大分子，結構復雜，影響因素眾多，是一項難度很大的挑戰，有效手段還比較缺乏；同時目前普遍存在的酶的穩定性與工業生產所需的苛刻條件之間的矛盾也是制約酶的大規模產業化應用的一個瓶頸。對CPO而言，反應體系中經常會使用酸、堿、有機溶劑或反應溫度較高等相對極端的條件，都會引起CPO變性失活。因此，提高CPO對溫度、有機溶劑等導致失活因素的抵抗能力、增強其在極端反應環境中的適應性對提升酶的產業化應用潛能是很有意義的。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于克服上述氯過氧化物酶存在的缺點，提供一種能夠有效提高氯過氧化物酶的催化活性，改善其高溫熱穩定性及對有機溶劑的抗失活性能的小分子脂肪酸化學修飾氯過氧化物酶的方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案是由下述步驟組成：

1、配制溶液

將小分子脂肪酸溶于質量分數為4％的二甲基亞砜水溶液中，配制濃度為0.5mmol/L的小分子脂肪酸溶液；將氯過氧化物酶溶于pH值為5.0的磷酸緩沖液中，配制濃度為5×10^-6mol/L的氯過氧化物酶溶液。

上述的小分子脂肪酸為十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸中的任意一種。

2、預處理透析袋

將透析袋用體積分數為50％的乙醇水溶液煮沸1小時，冷卻，依次用體積分數為50％的乙醇水溶液、0.01mol/L的NaHCO₃水溶液、0.001mol/L的乙二胺四乙酸水溶液、蒸餾水洗滌，再浸泡于蒸餾水中，放置在4℃冰箱中待用。

3、修飾反應

將濃度為5×10^-6mol/L氯過氧化物酶溶液與濃度為0.5mmol/L的小分子脂肪酸溶液混合，氯過氧化物酶與小分子脂肪酸的摩爾比為1∶15～30，置于冰浴中，密封攪拌30～60分鐘。

4、后處理

將修飾反應后的溶液轉入步驟2預處理的透析袋中，放在4℃冰箱中，用pH值為5.0的磷酸緩沖液透析48小時，得到小分子脂肪酸修飾的氯過氧化物酶。

本發明的小分子脂肪酸優選為十八酸或二十酸或二十二酸，最佳為十八酸。

本發明的修飾反應步驟3中，氯過氧化物酶與小分子脂肪酸溶液的最佳摩爾比為1∶20。

本發明采用十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸等小分子脂肪酸對氯過氧化物酶進行化學修飾后，不僅有效提高了氯過氧化物酶的催化活性，而且改善了其高溫熱穩定性及對有機溶劑的抗失活能力。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。

實施例1

1、配制溶液

將0.142g十八酸溶于質量分數為4％的二甲基亞砜的磷酸緩沖液中，配制濃度為0.5mmol/L的十八酸溶液100mL；將100μL5×10^-4mol/L的氯過氧化物酶溶液用pH值為5.0的磷酸緩沖液稀釋至100mL，配制成濃度為5×10^-6mol/L的氯過氧化物酶溶液。

2、預處理透析袋

將透析袋用150mL體積分數為50％的乙醇水溶液煮沸1小時，冷卻，依次用體積分數為50％的乙醇水溶液、0.01mol/L的NaHCO₃水溶液、0.001mol/L的乙二胺四乙酸水溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌，然后浸泡于蒸餾水中，放置在4℃冰箱中待用。

3、修飾反應