[發(fā)明專利]一種用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110276701.4
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號(hào): CN102286453A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于殿宇;杜晶;王立琦;梁單瓊;王妍;王雪;李越;張佳寧;時(shí)敏;陳曉慧;李志平;奚會(huì)松;宋云花;周旋
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/12
• 分類號(hào): C12N11/12;C12N11/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶的方法，其特征在于用復(fù)合膜來固定化磷脂酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：一、復(fù)合膜的制備：將5g醋酸纖維素溶于100mL丙酮中，待溶解完全成均一的膜液后，取實(shí)驗(yàn)前制備好的聚丙烯膜浸于溶有醋酸纖維素的丙酮溶液中，自然成膜，以去離子水沖洗醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜數(shù)次干燥備用；二、磷脂酶的固定化：取若干份1cm²的醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和pH＝5.0的磷酸氫二鈉/檸檬酸緩沖液，恒溫?cái)嚢栉揭欢〞r(shí)間(25℃，160r/min)。再加入一定量戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取出酶膜，用去離子水沖洗，放于干燥處待其風(fēng)干后測定酶活。三、酶活力的測定：一定量的底物無油磷脂溶于預(yù)定pH值的緩沖液中，經(jīng)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?，混合均勻。?個(gè)100mL三角瓶，2個(gè)作為空白瓶，2個(gè)作為樣品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95％乙醇15mL，于預(yù)定溫度的水浴中預(yù)熱5min，然后在各瓶中加入1cm²的固定化酶膜，立即混勻計(jì)時(shí)，在預(yù)定溫度的水浴中180r/min的條件振蕩準(zhǔn)確反應(yīng)15min，然后于樣品瓶中立即補(bǔ)加95％乙醇15mL終止反應(yīng)，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)堿液平均消耗量。四、固定化條件的優(yōu)化：吸附時(shí)間0.5～5.5h，酶液濃度0.02～0.07g/mL，戊二醛濃度0.1～0.6％，交聯(lián)時(shí)間2～7h，交聯(lián)溫度1～11℃的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。五、固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的討論：在溫度40～70℃，pH4.5～7范圍內(nèi)，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適pH值。并通過重復(fù)測定酶活來討論固定化酶的使用穩(wěn)定性。六、通過固定化酶膜的SEM圖像進(jìn)一步解釋利用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶的優(yōu)勢。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜與酶液在吸附時(shí)間1.5～5.5h的條件下進(jìn)行磷脂酶的吸附固定。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜與酶液在吸附時(shí)間，2.5～4.5h的條件下，酶液濃度0.03～0.07g/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜與酶液在吸附時(shí)間2.5～4.5h，酶液濃度0.04～0.07g/mL的條件下，戊二醛濃度0.2～0.5％。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜與酶液在吸附時(shí)間2.5～4.5h，酶液濃度0.04～0.07g/mL，戊二醛濃度0.3～0.5％的條件下，與戊二醛交聯(lián)3～6h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜與酶液在吸附時(shí)間2.5～4.5h，酶液濃度0.04～0.07g/mL，戊二醛濃度0.3～0.5％，與戊二醛交聯(lián)4～6h的條件下，交聯(lián)溫度3～11℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟五中將固定化酶與游離酶在溫度45～60℃條件下，比較固定化酶與游離酶的最適溫度。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟五中固定化酶與游離酶在pH5～6.5條件下，比較固定化酶與游離酶的最適pH值。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化磷脂酶，其特征在于步驟五中將固定化酶重復(fù)使用7次酶活測定方法，得到固定化酶的相對酶活力為原酶活的61％。