[發明專利]一種用于肝細胞培養的無血清培養基

有效

• 申請號: 201110276700.X
• 申請日: 2011-09-16
• 公開（公告）號: CN102311938A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 趙逸超;高毅;汪艷;潘明新;張志;簡國登
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學珠江醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京市立方律師事務所 11330
• 代理人: 劉延喜

技術領域

本發明涉及細胞培養用培養基，具體涉及一種用于肝細胞培養的無血清培養基。

背景技術

肝臟作為人體中最重要的器官之一，承擔著合成、分泌、代謝、解毒等多種復雜的功能。一旦由各種原因造成肝細胞的大量壞死，將會出現肝衰竭，導致機體代謝紊亂和毒性物質的堆積，而這反過來又加重了肝細胞的損傷，影響肝細胞的再生，進而形成肝衰竭的惡性循環。急性肝功能衰竭是一種嚴重的肝臟疾病，死亡率高達60～90％。目前，對此最有效的治療方法為肝臟移植。然而，由于供體器官缺乏、費用高昂、需長期使用免疫抑制劑等原因，往往在等待供體過程中，病人由于病情進展而迅速死亡，極大地限制了肝移植手術的廣泛開展。因此，以培養肝細胞為基礎的生物型人工肝技術成為終末期肝病患者向原位肝移植順利過渡、以及給急性肝功能衰竭患者受損肝臟提供得以再生和修復時機的重要手段。

目前認為，生物人工肝要達到理想支持效果，至少需要1010以上數量級的有較好功能的細胞，同時細胞自身及其生長的環境不能對人體產生負面的影響。然而動物細胞的生長均有賴于血清的存在，在普通培養基中，如不加血清，絕大部分細胞不能增殖。血清的主要作用在于提供細胞生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白和其它營養物質，維持細胞較好的生長狀態，促進細胞的生長與分裂增殖。

然而經研究發現，細胞培養中使用血清存在著多種缺點：首先，具有批間差異，不同批次血清間的生物活性和因子不一致，將會導致產品和實驗結果的重現性差，進而需要大量驗證工作；其次，血清的來源不穩定、成分不明確、以及有抑制生長的成分，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產品的分離純化；再者，存在污染外源病毒和致病因子的風險，容易被病毒和支原體感染；進一步，制品中殘留的牛血清易引起被接種者對血清的過敏反應，不利于動物實驗或者臨床試驗等問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于肝細胞培養的無血清培養基，其可在同等條件的肝細胞培養過程中有效地代替血清成分，提供細胞生長增殖所需的充足營養與良好環境，使細胞生長良好，并使細胞形態、密度、活力、功能與含血清培養基基本相同，以克服現有技術的不足。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種用于肝細胞培養的無血清培養基，其包含基礎培養基和添加組分。其中，所述添加組分包括：胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、表皮生長因子、肝細胞生長因子、纖粘連蛋白、地塞米松和胰高血糖素。上述添加組分中的各組分在該無血清培養基中的濃度為：

該基礎培養基為DMEM/F12(DMEM?NUTRIENT?MIX?F12)培養基、DMEM高糖培養基等培養基。

在本發明中，該胰島素可通過作用于肝細胞表面的胰島素受體，增強肝細胞對葡萄糖的攝入和利用，同時促進肝細胞內的RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，從而增強肝細胞的活力與功能。

該轉鐵蛋白的主要作用為調節體內鐵元素的代謝，通過細胞表面的轉鐵蛋白受體將鐵元素轉移到細胞內。同時，該轉鐵蛋白還可以與其他微量元素，如釩等結合，從而調節肝細胞的生長增殖與功能表達。

該亞硒酸鈉作為人體的必需微量元素硒的存在形式，起到保護細胞免受氧化應激的作用。

該表皮生長因子和肝細胞生長因子的主要作用為促進肝細胞的增殖，以及調節肝細胞的功能。

該纖粘連蛋白的主要作用為促進肝細胞的粘附，及其貼壁生長。

該地塞米松和胰高血糖素是體內重要的激素，參與肝細胞的糖代謝、脂類代謝等，能調節肝細胞的增殖與功能表達。

其中，該地塞米松是通過乙醇溶解獲得的，具體的方法為：稱取地塞米松粉末39.2mg，然后加入10ml的無水乙醇溶解，再加入無菌蒸餾水稀釋100倍，在4℃的溫度中保存備用。

該表皮生長因子是通過水溶解獲得的，其具體制備方法為：稱取表皮生長因子200ug，然后加入20ml滅菌蒸餾水溶解，在-20℃溫度中保存備用。

該肝細胞生長因子是通過水溶解獲得的，其具體制備方法如下：稱取肝細胞生長因子25ug，然后加入10ml滅菌蒸餾水溶解，在-20℃溫度中保存備用。

進一步，所述無血清培養基中還可含有HEPES，即4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸，其濃度為10mmol/L。該HEPES主要起到控制無血清培養基在較長的時間內保持恒定的PH值范圍的作用。