[發明專利]用于DMO的有效靶向的葉綠體轉運肽及其用途

有效

• 申請號: 201110275982.1
• 申請日: 2007-06-06
• 公開（公告）號: CN102337275A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: P·C·C·馮;M·瑪爾文;S·弗拉辛斯基
• 申請（專利權）人: 孟山都技術公司
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N5/10;A01H5/00;A01M21/04
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;尚繼棟

本申請是申請日為2007年6月6日、申請號為200780052290.2、發明名稱為“用于DMO的有效靶向的葉綠體轉運肽及其用途”的發明專利申請的分案申請。

發明背景

本申請要求于2007年2月26日提交的美國臨時專利申請60/891,675和2007年6月5日提交的美國專利申請1?1/758,659的優先權，本文完整引入其公開內容作為參考。

發明領域

本發明涉及植物生物技術領域。更具體的說，本發明涉及允許有效加工和定位植物中的麥草畏單加氧酶的葉綠體轉運肽的鑒定和用途。

相關技術描述

DMO(麥草畏單加氧酶)在植物中催化除草劑麥草畏(3，6-二氯-鄰茴香酸)降解為無毒的3，6-二氯水楊酸(3，6-DCSA)，從而賦予除草劑耐受性。DMO的活性需要用于將電子從NADH向麥草畏轉移的兩種中間蛋白質：還原酶和鐵氧還蛋白(美國專利7,022,896；Herman等人，2005)。然而，轉基因植物中的麥草畏耐受性已通過單獨用DMO轉化得到證明，表明植物內源性的還原酶和鐵氧還蛋白可以在電子轉移中代替。參與電子轉移的植物鐵氧還蛋白位于質體中。因此，為了獲得DMO的高效性能并因此獲得提高的麥草畏耐受性，需要將DMO靶向至葉綠體。

在許多情況下，這種靶向可以通過被稱作葉綠體轉運肽(CTP)或者質體轉運肽的N-末端延伸的存在而實現。如果表達的多肽將要在植物質體(如葉綠體)中區室化，細菌來源的染色體轉基因必須具有與編碼表達的多肽的序列相融合的編碼CTP序列的序列。因此，將外源多肽定位到葉綠體中通常是借助于將編碼CTP序列的多核苷酸序列可操作地連接到編碼外源多肽的多核苷酸的5’區域上來完成的。CTP在向質體內轉移過程中通過加工步驟被去除。但是，加工效率可能受CTP的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影響。

Weeks等人(美國專利7,022,896)描述了玉米cab-m7信號序列(參見，Becker等人，1992和PCT?WO?97/41228；GenBank登記號X53398)和豌豆谷胱甘肽還原酶信號序列(Creissen等人，1992和PCT?WO?97/41228)在將DMO靶向至植物質體方面的潛在用途，但是沒有給出關于加工或者靶向效率的數據。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亞基編碼序列的27個氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基(RbcS)CTP，也已經用于將DMO靶向至葉綠體(例如，美國臨時申請60/811,152)。然而，已經在蛋白質印跡(Western?blot)分析過程中發現，這種豌豆RbcS?CTP產生一個正確加工的DMO蛋白質條帶(～38?kDa)，但是還產生一個與DMO和RbcS編碼區的27個氨基酸相對應的較大的條帶(～41kDa)。額外的氨基酸可能不利地影響DMO的活性。此外，由于DMO的不完全加工，轉基因產品中額外的蛋白質造成監管方面的障礙，為了使產品在政府機構注冊的目的，還需要在產品表征方面投入額外的努力，由此增加了產品注冊的費用。因此，需要鑒定有效地產生正確加工的DMO的CTP，從而提供完全的DMO活性以及易于表征產品的優點。

發明概述

本發明的一方面涉及一種重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列上的編碼葉綠體轉運肽的核苷酸序列，其中，該核苷酸序列編碼包括選自SEQ?ID?NOs：1-11的序列的葉綠體轉運肽。在某些實施方案中，重組DNA分子包括選自SEQ?ID?NOs：12-22的核苷酸序列。在某些實施方案中，重組DNA分子包括編碼選自SEQ?IDNOs：24、26、28、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列。包括與在植物細胞中具有功能的啟動子可操作地連接的DNA分子的DNA構建體也是本發明的一方面。