[發明專利]一種氨芐青霉素抗性質粒載體及其制備與應用

有效

• 申請號: 201110273904.8
• 申請日: 2011-09-15
• 公開（公告）號: CN102329811A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 傅向陽;李威
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海脫穎律師事務所 31259
• 代理人: 李強

技術領域

本發明涉及分子生物學和微生物學領域。具體地講，本發明涉及一種β-內酰胺酶泄漏減少的氨芐青霉素抗性質粒載體及其制備與應用。

背景技術

1973年，美國科學家發明了重組DNA技術，標志著人類認識生命本質并能按照自己意愿改造生命的新時期開始。在這之后的三十多年里，以重組DNA技術為基礎的基因工程得到了蓬勃發展。基因工程技術通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，實現基因改造和重新組合，然后導入宿主細胞進行無性繁殖，并誘導重組基因的表達，產生出所需要的基因產物。基因工程技術不僅在基礎研究中有著廣泛的應用，也在數以千億美元計的生物技術產業中發揮著重要作用。

載體是用來協助將目的基因引入宿主細胞進行增殖或表達的DNA片段。基因工程中常用的載體主要包括質粒、噬菌體和病毒三大類，其中以質粒的使用最為廣泛。質粒是獨立于細胞染色體外具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA。最早使用的質粒載體是pBR322，它是一人工構建的DNA片段，分子大小為4.3kb，帶有抗氨芐青霉素和抗四環素基因以利于篩選的標志基因，并含有EcoRI、BamHI、HindIII等單一的限制酶切點以方便目的基因的克隆。

現今使用的質粒大多來自pBR322的改造，它們的一個共同特點是使用抗氨芐青霉素基因作為篩選標志。氨芐青霉素是現今使用最廣泛的抗生素，它的抑菌機理是使細菌細胞膜的內層轉肽酶失活從而抑制細胞壁的合成，細菌因無法合成完整的細胞壁而導致無法生長。抗氨芐青霉素基因(bla)編碼β-內酰胺酶(β-lactamase)，β-內酰胺酶在胞質內合成后經自身信號肽引導進入周質空間(細胞內、外膜之間一狹窄區域)。跨膜后，信號肽被信號肽酶切除，產生成熟的β-內酰胺酶。β-內酰胺酶水解氨芐青霉素的β-內酰胺環使其失效，轉化菌因而也得以在氨芐青霉素存在的環境下生長。可以看出，β-內酰胺酶分泌至周質空間是轉化菌產生氨芐青霉素抗性的先決條件。有研究表明，大腸桿菌外膜蛋白的信號肽引導β-內酰胺酶至周質空間的效率相比β-內酰胺酶的自身信號肽要高出100倍以上。

然而，因為尚未知的原因，分泌至周質空間的β-內酰胺酶可進一步泄漏至胞外，將胞外環境中的氨芐青霉素破壞掉。當轉化菌在瓊脂固體培養基上培養時，泄漏至胞外的β-內酰胺酶在轉化菌周圍形成一個無氨芐青霉素選擇壓力的區域，在那個區域非轉化菌也能夠生長，形成大家所熟知的“衛星菌落”，這會干擾對轉化菌的挑選。當轉化菌被應用于液體培養基中培養時，β-內酰胺酶的泄漏會造成更嚴重的問題。由于β-內酰胺酶的迅速擴散，液體培養基中的氨芐青霉素會被全部破壞掉，使得整個環境的選擇壓力消失。轉化菌細胞中的質粒存在分離不穩定性，質粒在細胞分裂過程中不是平均分配，在細胞分裂時會產生不含有質粒的細胞。在選擇壓力消失的環境中，不含有質粒的細胞會迅速生長。因為不含有質粒的細胞代謝負擔比含有質粒的細胞要輕，不含有質粒的細胞生長速度比含有質粒的細胞要快。由于存在競爭優勢，培養物最終將被不含有質粒的細胞所主導，含有質粒的細胞在培養物中只占很小的比例，這對相關的應用如質粒的抽提、蛋白質的表達等會造成嚴重的負面影響。

培養基中氨芐青霉素的選擇壓力也會因為受培養基酸化影響而被破壞。隨著培養時間的延長，細菌的代謝活動促使培養基的pH降低，而氨芐青霉素在酸性環境下易發生水解，這個問題可以通過調控培養基的pH或者采用羧芐青霉素來避免，因為羧芐青霉素在酸性環境中的穩定性相比氨芐青霉素要高很多。但是，羧芐青霉素的價格是是氨芐青霉素的數倍；而且，跟氨芐青霉素一樣，羧芐青霉素不能抵抗β-內酰胺酶的水解作用。因此，減少甚至消除β-內酰胺酶的泄漏對于保持培養環境中的選擇壓力是至關重要的。

對于以重組蛋白質表達為目的的培養而言，保持培養環境的選擇壓力非常重要。如果選擇壓力消失，導致最終培養物中無質粒的細胞占主導，則由于目的基因的丟失，目標蛋白質的表達水平將很低。一些方法已經被報道用來減少β-內酰胺酶泄漏造成的負面影響，包括在培養物中加入β-內酰胺酶的抑制劑甲氧苯青霉素；洗滌細胞以去除β-內酰胺酶；使用高度稀釋的培養物用于接種等。但是，這些方法并不解決β-內酰胺酶的泄漏問題，只是β-內酰胺酶的泄漏后的補救措施。因為每批次的培養都需要進行這些操作，這些方法費事、也不經濟。同時，由于β-內酰胺酶的不斷合成和泄漏，這些方法的效果是有限的。

發明內容