[發明專利]利用纖突展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗

無效

• 申請號: 201110273901.4
• 申請日: 2007-08-22
• 公開（公告）號: CN102335423A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 扈榮良;張守峰;劉曄;李忠
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/205
• 分類號: A61K39/205;C12N15/861;C12N15/66;A61P31/14
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 趙正

技術領域：

本發明涉及利用犬II型腺病毒不同結構蛋白的特性，分別展示狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組疫苗，可用于新型動物狂犬病疫苗的研制和應用。?

背景技術：

狂犬病是由狂犬病病毒引起的以非化膿性腦脊髓炎為主要特征的一種重要人畜共患傳染病，感染人和動物后，一旦發病，死亡率幾乎是100％。我國是狂犬病的多發地，每年有上千人死于狂犬病，主要是由帶病毒的犬咬傷引起。盡管目前人用商品疫苗安全有效，但大量帶毒動物的存在仍然對人類生命安全構成了直接威脅。特別是近年來，死于狂犬病的人數呈逐年上升的趨勢。因此，減少或控制狂犬病病毒在家養動物中的貯集是有效控制人狂犬病發生的重要途徑。?

目前用于動物狂犬病預防的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗，二者對預防狂犬病的發生起到了積極重要的作用。但是滅活疫苗免疫周期短，接種方式單一，不適于動物的田間免疫，而且在我國還沒有實現國產化，進口滅活疫苗制備工藝復雜，成本昂貴，比較適用于發達國家。弱毒疫苗在敏感動物體內有毒力返祖的危險，不能從根本上消除狂犬病，因此，難以在我國得到推廣。?

隨著對狂犬病病毒分子生物學特性的不斷研究，已證明糖蛋白是唯一可以誘導機體產生中和抗體的狂犬病病毒結構蛋白。國際上許多實驗室都開展了以糖蛋白為保護性抗原的亞單位疫苗、基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗等新型狂犬病疫苗的研究。雖然這些疫苗可以誘導特異性中和抗體的產生，并具有一定的免疫保護力，但由于免疫原性較弱，未得到實際應用。以痘病毒和人5型腺病毒為載體表達狂犬病病毒糖蛋白的活載體重組疫苗研究取得了一定進展，在歐洲和北美洲的免疫試驗證明，具有良好的免疫原性。但由于存在再次免疫排斥或安全性問題，而未得到正式批準使用。為提高重組腺病毒疫苗的實際應用價值，目前，以人5型腺病毒為載體的展示疫苗已有研究，而以犬II型腺病毒為載體的展示疫苗技術在國內外尚未見報道。?

以犬II型腺病毒為載體的重組疫苗對犬科動物易感，也可在貓、牛和豬等家畜動物體內有效復制，而且遺傳特性穩定，安全性好，在新型狂犬病疫苗的研究中具有較大的開發潛力。本實驗室構建的表達狂犬病病毒糖蛋白的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，已獲得國家發明專利，并完成了在生產性試驗階段的生物安全評價，證明具有良好的免疫效果和安全性。在此基礎上，為進一步提?高犬II型腺病毒重組疫苗的免疫效力和實際應用價值，本發明提供了一系列以犬II型腺病毒結構蛋白展示表達狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組疫苗。?

發明內容：

本發明要解決的技術問題是提供利用纖突展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗。?

本發明的技術方案是以犬II型腺病毒為載體，在其結構蛋白基因的疏水性位點插入狂犬病病毒保護性抗原基因或表達抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結構蛋白融合表達。?

進一步講，以犬II型腺病毒疫苗株為載體，在其結構蛋白六鄰粒、纖突或IX蛋白上，利用這些結構蛋白基因自身的轉錄原件，融合表達狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位，使其在犬II型腺病毒顆粒表面得以展示，從而達到增強重組疫苗免疫效力的目的。免疫試驗證明，該系列重組疫苗均可誘導產生高滴度的針對狂犬病病毒和犬腺病毒的中和抗體，并能抵抗狂犬病病毒標準強毒株和犬腺病毒強毒株的攻擊。?

首先，在不發生堿基缺失和不影響結構蛋白轉錄的前提下，對犬II型腺病毒全基因組中六鄰粒、纖突或IX蛋白基因進行改造：?

1、過重疊PCR分別在犬II型腺病毒全基因組六鄰粒基因超變區的4個位點，按六鄰粒的轉錄閱讀框分別插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與六鄰粒在腺病毒顆粒外表面融合表達；?

2、在犬II型腺病毒全基因組28106bp處引入一段人工合成的核酸序列(含Xma?I酶切位點)，在Xma?I酶切位點處，按纖突的轉錄閱讀框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與纖突在腺病毒顆粒外表面融合表達；?

3、利用犬II型腺病毒IX蛋白基因內的限制性內切酶Ase?I位點，在IX蛋白轉錄終止密碼子處插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區基因和SV40病毒多聚A轉錄終止信號，使IX蛋白與外源抗原表位利用同一轉錄閱讀框在腺病毒顆粒外表面融合表達。?