[發明專利]用RNAi有效防治昆蟲及蜘蛛類有害生物的方法

無效

• 申請號: 201110273637.4
• 申請日: 2011-09-15
• 公開（公告）號: CN102550594A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 牛長纓;葉政培;王智健;林擁軍;高希武
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A01N57/16
• 分類號: A01N57/16;A01P23/00;A01P7/04;A01P7/00
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

1.用RNAi有效防治昆蟲及蜘蛛類有害生物的方法，其特征在于用注射的方式將大于20bp的針對昆蟲及蜘蛛類有害生物的HMG-CoA還原酶基因的雙鏈RNA序列導入有害生物體內，抑制昆蟲及蜘蛛類有害生物的HMG-CoA還原酶的表達，抑制保幼激素合成，導致有害生物死亡或者絕育，從而防治有害生物，

注射的具體作法是：

(1)提取總RNA，反轉錄全部mRNA為cDNA，根據已知的昆蟲及蜘蛛類有害生物的HMGR基因設計特異性引物，PCR擴增特異片段，獲得HMGR基因片段，從瓊脂糖凝膠中回收HMGR基因片段，

將HMGR基因片段連接到T載體上，并且轉化到大腸桿菌中擴增培養，提取擴增培養后大腸桿菌中的帶有害蟲的HMG-CoA還原酶基因片段T載體質粒；

(2)設計帶有啟動子的特異引物對，用來為目的片段加上啟動子序列，PCR擴增獲得兩端帶有啟動子的害蟲的HMG-CoA還原酶基因片段，并回收純化；

(3)體外合成HMG-CoA還原酶基因特異dsRNA片段為dsRNAH，EGFP基因特異dsRNA片段為dsRNAE，純化，最后獲得針對害蟲HMG-CoA還原酶基因的雙鏈RNA片段和針對EGFP基因的雙鏈RNA片段：

(4)dsRNA的注射：

用RNase-free?H₂O配制注射緩沖液，注射緩沖液中KCl終濃度5mmol/L，Na₂HPO₄終濃度1mmol/L，用注射緩沖液配制出HMG-CoA?reductase基因特異dsRNA注射液，從雌性成蟲蟲體第3和第4腹節節間膜處注射入蟲體dsRNAH注射液；

(5)注射后，按1∶1的雌雄比例配對飼養；

所述大于20bp的針對昆蟲及蜘蛛類的HMG-CoA還原酶基因的雙鏈RNA序列為登陸號：GenBank：X70034.1、登陸號：GenBank：GU584103.1序列及其互補序列。

2.根據權利要求1所述的用RNAi有效防治昆蟲及蜘蛛類有害生物的方法，其特征在于提取有害生物的總RNA的有害生物德國小蠊、棉鈴蟲的飼養條件為28±1℃，相對濕度為50％-70％，光周期為L14:D10。