[發明專利]利用微流控芯片篩選蛋白質的核酸適體的方法

無效

• 申請號: 201110273017.0
• 申請日: 2011-09-15
• 公開（公告）號: CN102321616A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 羊小海;王青;王柯敏;邢煜騫;江銳
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術領域

本發明涉及一種核酸適體的篩選方法，尤其涉及一種利用特定裝置篩選靶標蛋白質特異性核酸適體的方法。

背景技術

核酸適體（aptamer），也稱為核酸適配子，是經過一種新型的體外篩選技術——指數富集配基的系統進化技術（SELEX）篩選得到的，其是從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中得到的能特異性結合靶物質的單鏈寡聚核苷酸，可以是DNA也可以是RNA，長度一般為25～60個核苷酸。核酸適體的出現，打破了傳統意義上關于核酸只是遺傳信息存儲和轉運載體的認識，利用核酸結構的多樣性，可使核酸適體高效、特異地結合各種靶分子。核酸適體具有易合成、易修飾、易存儲等優點，可廣泛用于蛋白質的分析檢測、生物傳感器、分子開關的開發、醫學診斷治療等方面。但是由于常規的SELEX方法中的篩選輪數一般為8～20輪，有時甚至需要30輪才能篩選出一條可以應用的核酸適體，所以目前已篩選出的核酸適體種類較少，只有幾百種。因此，為了獲得更多種核酸適體，有必要提高其篩選效率。

微流控芯片，也稱芯片實驗室（Lab-on-a-chip），是利用微電子機械系統技術（Micro-electro-mechanical?Systems，MEMS）在玻璃、硅和有機高分子聚合物等基片表面，構建微管、微池、微泵等分析單元和系統，或基于芯片毛細管電泳技術，以實現樣品進樣、生物和化學反應、預濃縮、分離和檢測等功能，微流控芯片具有快速、高效、高通量、低成本、低樣品量、可批量分析等優點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種通用性強、篩選時間短、篩選效率高、篩選效果好的利用微流控芯片篩選蛋白質的（特異性）核酸適體的方法。

為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種利用微流控芯片篩選靶標蛋白質特異性核酸適體的方法，包括以下步驟：

（1）優化核酸文庫：將預先設定的起始核酸文庫先與非靶標蛋白質孵育，得到用于靶標蛋白質核酸適體篩選的優化核酸文庫；

（2）修飾微珠：將所述靶標蛋白質先與微珠孵育，將修飾有靶標蛋白質的微珠置入一微流控芯片通道內；

（3）初篩：將所述優化核酸文庫通入所述微流控芯片通道內，該通道內的微珠上修飾的靶標蛋白質與所述優化核酸文庫中部分核酸分子結合，經過在該微流控芯片通道內的沖洗、洗脫，得到與所述靶標蛋白質結合的初篩核酸文庫；

（4）純化：將上述得到的初篩核酸文庫進行PCR擴增，擴增產物通過鏈霉親和素微珠填充的親和柱進行分離，再通過堿變性解鏈、脫鹽后形成次一級核酸文庫；

（5）循環：以上述得到的次一級核酸文庫替代所述起始核酸文庫并重復上述的步驟（1）～步驟（4），直至得到包含有與所述靶標蛋白質高親和力和高特異性結合的核酸適體的核酸文庫。

上述的利用微流控芯片篩選靶標蛋白質特異性核酸適體的方法中，所述靶標蛋白質可以為血液中的各種常規蛋白質。根據我們的實驗結果，所述血液中的常規蛋白質優選為肌紅蛋白或C反應蛋白。

上述的利用微流控芯片篩選靶標蛋白質特異性核酸適體的方法中，優選的所述起始核酸文庫主要包含70～80個堿基的DNA序列，該DNA序列兩端優選為15～20個堿基的引物序列，該DNA序列中段優選為40個堿基的隨機序列，所述起始核酸文庫容量優選在10¹⁴以上。

上述的利用微流控芯片篩選靶標蛋白質特異性核酸適體的方法中，所述非靶標蛋白質優選是指與所述靶標蛋白質同族或相似的蛋白質，或者是與所述靶標蛋白質在同一環境或體系中的蛋白質。

上述的利用微流控芯片篩選靶標蛋白質特異性核酸適體的方法中，優選的，所述微流控芯片的通道兩端分別設有進樣口和出樣口，所述通道上設有收縮段以形成一用于阻擋微珠通過的狹窄通道。所述通道的寬度優選在150μm以上，通道的高度優選在50μm以上，所述收縮段的高度優選為10μm～18μm，所述微珠（優選聚苯乙烯微珠）的粒徑優選為20μm～40μm。

上述的利用微流控芯片篩選靶標蛋白質核酸適體的方法中，步驟（2）中的微珠孵育后可優選用封閉劑封閉，所述封閉劑優選為牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）或脫脂奶粉?。