[發(fā)明專利]一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110272927.7
• 申請日: 2011-09-15
• 公開（公告）號: CN102417893A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發(fā)明（設計）人: 張守全;白銀山
• 申請（專利權）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發(fā)明涉及細胞分離培養(yǎng)領域，具體涉及一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細胞的方法。?

背景技術

精原干細胞（Spermatogonial?stem?cells，SSCs）是哺乳類動物雄性成體內(nèi)唯一可將遺傳信息傳遞給下一代的干細胞，它具有多潛能性，能被誘導分化成多種類型的細胞，在一定情況下它還能生成擬胚體，是一種天然不用轉(zhuǎn)基因就能得到IPS細胞良好材料，而且它生成精子，完成基因的傳遞，伴隨著轉(zhuǎn)基因技術的興起，它成為一種新的轉(zhuǎn)基因途徑。?

精子發(fā)生是一個復雜的過程，是維持雄性生殖能力和生命延續(xù)的前提。深入了解精子發(fā)生的分子和細胞機理，保護瀕危動物物種以及治療人類因化療和放療引起的內(nèi)源性SSCs?損傷和恢復男性生育能力。精原干細胞技術與動物選種工作相結合，將會大規(guī)模的生產(chǎn)出優(yōu)良家畜。?

SSCs具有多潛能性并分化為來源于三胚層的多種組織細胞，精原干細胞為今后細胞替代療法和組織器官移植的來源成為可能。其在組織工程、細胞移植、基因治療等領域的運用提供了研究基礎，對臨床醫(yī)學有較大應用價值。?

精原干細胞不僅對生物學、生物學技術、醫(yī)學和發(fā)育學等方面的研究具有特殊的價值，使其成為近年來國內(nèi)外的研究熱點。?

目前研究主要SSCs的分離方法主要集中在機械法和兩步酶法消化；而純化方法主要有：差速貼壁法，percoll密度梯度離心法，自然重力沉降法，流式細胞術分選以及免疫磁珠等分選等方法，各種方法都存在著優(yōu)缺點，根據(jù)需要來選擇。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的細胞分離培養(yǎng)中存在的不足，提供一種獲得細胞容易，培養(yǎng)時間短，細胞增殖快、狀態(tài)好且操作簡便，實驗成本低的分離培養(yǎng)豬精原干細胞的方法。?

本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)：?

一種一步酶法分離培養(yǎng)豬精原干細胞的方法，包括如下步驟：

（1）將仔豬的睪丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗滌2~3次，去除血污；

（2）去掉睪丸白膜和結締組織，將剩下的睪丸組織剪成小塊，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中；

（3）加入10倍體積的PBS，用吸管吹打，靜置，待睪丸組織沉到底部后，棄上清；

（4）重復步驟（3）2~3次；

（5）加入10倍體積的膠原酶消化，于37?℃的水浴鍋100?rpm，然后用吸管吹打，直到看不到組織塊；

（6）加入5~10?ml的PBS，吹打，在16?℃、600?rpm離心5?min，棄上清，收集底部細胞；

（7）用差異貼壁培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為5×10⁶個/ml，接種到事先用0.1?%明膠包被的培養(yǎng)瓶中，在無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述細胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37?℃，5?%?CO₂，飽和濕度。?

通過MTT法對比三種培養(yǎng)基，DMEM、DMEM-F12、α-MEM以及血清濃度5?%，10?%，15?%三種濃度培養(yǎng)效果，得出了DMEM、15?%血清濃度最為適合豬SSCs的增殖培養(yǎng)。根據(jù)文獻報道，添加非必需氨基酸；β-巰基乙醇，L-谷氨酰胺等是培養(yǎng)細胞基礎，起到了營養(yǎng)，抗氧化和能量物質(zhì)的作用。如表一所示：?

表1?不同培養(yǎng)基和血清濃度對豬SSCs增殖率的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標字母相同或未標表示差異不顯著（p＞0.05），字母不同表示差異顯著（p＜0.05）。

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根據(jù)表1，兩因素方差分析結果顯示，培養(yǎng)3?d后，不同培養(yǎng)基對豬SSCs增殖率無顯著性影響，但是培養(yǎng)5?d后，DMEM和DMEM/F₁₂處理組的豬SSCs增殖率顯著高于α-MEM組，而培養(yǎng)7?d后，DMEM處理組的豬SSCs增殖率顯著高于α-MEM組和DMEM/F₁₂組；培養(yǎng)3?d后，不同血清濃度對豬SSCs增殖率也無顯著性影響，但是培養(yǎng)5?d和7?d后，血清濃度為15?%處理組的豬SSCs增殖率顯著高于5?%和10?%血清濃度組。多重比較結果顯示，培養(yǎng)3?d后，當血清濃度為5?%、培養(yǎng)基為DMEM/F₁₂時，豬SSCs增殖率最低；而培養(yǎng)5?d和7?d后，血清濃度為15?%、培養(yǎng)基為DMEM時，豬SSCs增殖率最高。可見DMEM培養(yǎng)體系是更適合豬SSCs的培養(yǎng)體系。