[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻土壤環(huán)境安全的評(píng)價(jià)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110271631.3
• 申請(qǐng)日: 2011-09-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102373274A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐海圣;呂孫建;何琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/06;C12R1/90
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻土壤環(huán)境安全的評(píng)價(jià)方法，其特征是包括以下步驟：

1)、轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻水浸泡液和和非轉(zhuǎn)基因水稻水浸泡液的制備：

在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻秸梗中按照1g/20～30ml的料液比加入蒸餾水，于25～27℃浸泡3.5～14天，過(guò)濾，得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻水浸泡液；

在非轉(zhuǎn)基因水稻秸梗中按照上述相同的料液比加入蒸餾水，于上述相同的溫度浸泡相同的時(shí)間，過(guò)濾，得非轉(zhuǎn)基因水稻水浸泡液；

2)、草履蟲(chóng)母液的培養(yǎng)；

將普通水稻秸梗按照1g/20～30ml的料液比加入蒸餾水，煮沸至少0.5小時(shí)，過(guò)濾，得普通水稻水浸煮沸液；

將大草履蟲(chóng)放入所述普通水稻水浸煮沸液中進(jìn)行培養(yǎng)，得草履蟲(chóng)培養(yǎng)母液；所述草履蟲(chóng)培養(yǎng)母液中草履蟲(chóng)的密度為(0.8～1.2)×10³ind/mL；

3)、用轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻水浸泡液和非轉(zhuǎn)基因水稻水浸泡液分別培養(yǎng)草履蟲(chóng)：

將草履蟲(chóng)培養(yǎng)母液按照1∶90～110的體積比加入至轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻水浸泡液中作為轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液，于25～27℃恒溫培養(yǎng)6～8天；

將草履蟲(chóng)培養(yǎng)母液按照相同的體積比加入至非轉(zhuǎn)基因水稻水浸泡液中作為非轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液，于上述相同的溫度培養(yǎng)相同的時(shí)間；

4)、草履蟲(chóng)細(xì)胞密度的計(jì)數(shù)：

從上述步驟3)所述培養(yǎng)的第2天起，每天對(duì)上述轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液以及非轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液進(jìn)行草履蟲(chóng)細(xì)胞密度的檢測(cè)；

5)、當(dāng)上述步驟4)的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液中的草履蟲(chóng)細(xì)胞密度≥1×10³ind/mL，取該轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液作為草履蟲(chóng)DNA的損傷檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液；

當(dāng)上述步驟4)的非轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液中的草履蟲(chóng)細(xì)胞密度≥1×10³ind/mL，取該非轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液作為草履蟲(chóng)DNA的損傷檢測(cè)的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液；

6)、密度差異進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：

將步驟4)所得的非轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液的草履蟲(chóng)細(xì)胞密度相對(duì)于相同培養(yǎng)天數(shù)所得的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)液的草履蟲(chóng)細(xì)胞密度進(jìn)行單因素方差分析，

如果P＞0.05，則繼續(xù)進(jìn)行下述步驟7)；

如果P≤0.05，則判定所述轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤環(huán)境不安全；

7)、對(duì)草履蟲(chóng)DNA的損傷檢測(cè)，依次進(jìn)行以下步驟：

A)、將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度(0.8～1.2)×10⁵ind/mL的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液，將非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度相同的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液；

B)、取2份非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液，其中一份作為陰性對(duì)照；在另一份中加入雙氧水進(jìn)行染毒，作為陽(yáng)性對(duì)照；

C)、彗星電泳技術(shù)，依次進(jìn)行以步驟：

①、對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別進(jìn)行彗星電泳技術(shù)，依照彗星電泳的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分別得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)、陰性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)和陽(yáng)性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)；

②、預(yù)先的實(shí)驗(yàn)有效性的判斷：

如果，陽(yáng)性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)相比的P＞0.05，則判定該彗星電泳實(shí)驗(yàn)無(wú)效；

如果，陽(yáng)性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)相比的P≤0.05，則判定該彗星電泳實(shí)驗(yàn)有效，從而繼續(xù)進(jìn)行以下步驟③；

③、得出結(jié)論：

如果，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)相比的P＞0.05，則判定所述轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤環(huán)境安全；

如果，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)與陽(yáng)性對(duì)照的彗星電泳判斷數(shù)據(jù)相比的P＞0.05，則判定所述轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤環(huán)境不安全。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻土壤環(huán)境安全的評(píng)價(jià)方法，其特征是：在彗星電泳技術(shù)中：

根據(jù)細(xì)胞慧星熒光尾部(T)與其可見(jiàn)頭部(H)的比例，將損傷程度分為0級(jí)、1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)和4級(jí)，

損傷程度＜5％，為0級(jí)；

5％≤損傷程度＜20％，為1級(jí)；

20％≤損傷程度＜40％，為2級(jí)；

40％≤損傷程度＜95％，為3級(jí)；

95％≤損傷程度，為4級(jí)；

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別拍攝數(shù)量相同的細(xì)胞；

當(dāng)所述彗星電泳的判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞的拖尾率時(shí)，則用CASP軟件統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照所對(duì)應(yīng)的拖尾率；如果，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液的拖尾率與陰性對(duì)照的拖尾率相比的P＞0.05，則判定所述轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤環(huán)境安全；如果，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液的拖尾率與陽(yáng)性對(duì)照的拖尾率相比的P＞0.05，則判定所述轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤環(huán)境不安全；

或者當(dāng)所述彗星電泳的判斷標(biāo)準(zhǔn)為DNA損傷專用單位時(shí)，所述DNA損傷專用單位的計(jì)算規(guī)則如下：

DNA損傷專用單位＝0×0級(jí)細(xì)胞數(shù)+1×1級(jí)細(xì)胞數(shù)+2×2級(jí)細(xì)胞數(shù)+3×3級(jí)細(xì)胞數(shù)+4×4級(jí)細(xì)胞數(shù)；

如果，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液的DNA損傷專用單位與陰性對(duì)照的DNA損傷專用單位相比的P＞0.05，則判定所述轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤環(huán)境安全；如果，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮液的DNA損傷專用單位與陽(yáng)性對(duì)照的DNA損傷專用單位相比的P＞0.05，則判定所述轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤環(huán)境不安全。