[發明專利]多重PCR-反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法

有效

• 申請號: 201110271351.2
• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102312001A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 孫群;張舒林;郭建華;羅濤;趙于丁;湯科;楊志榮
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 成都天嘉專利事務所(普通合伙) 51211
• 代理人: 趙麗

1.一種多重PCR-反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于：

A、多重PCR的反應在一個管中完成，且一次性PCR擴增至少四個待檢測DNA片段；

B、反向斑點雜交中所述的低密度探針陣列至少包括19條能夠同時檢測與RIF、EMB和INH耐藥相關的rpoB，katG，inhA基因調節區和embB基因突變熱點區的堿基突變以及對結核桿菌復合群進行菌種鑒別診斷的探針；

C、所述的帶有羧基而呈負電的雜交膜，與氨基標記的寡核苷酸探針共價結合，形成橋式結構；

D、多重PCR中的引物采用鏈霉親和素－堿性磷酸酶結合的生物素進行標記，通過催化底物BCIP/NBT反應形成有顏色的物質來判定雜交的陽性和陰性，反映PCR產物與探針有無突變。

2.?根據權利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于：所述多重PCR中的多條引物的Tm值相差?≤3℃，擴增產物片段大小相差50-77堿基對。

3.根據權利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于：所述探針為18條寡核苷酸探針和1條MTC群特異性探針。

4.根據權利要求1所述的一種基于多重PCR的反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于：所述探針長度為20±3個堿基；將盡可能錯配的堿基位點即突變位點設置在探針中部；各探針的Tm值盡量相近，相差應?≤3℃。

5.根據權利要求1或3所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于：所述的多重寡核苷酸探針陣列的構成方法如下：

用0.5mol/L??Na₂CO₃/NaHCO₃緩沖液溶解探針，稀釋濃度為?20?μM，充分混勻后，冰箱保存備用，緩沖液的pH為8.4；

把Biodyne?C尼龍膜剪成一定大小，并用鉛筆劃定區域；

先應用?16%乙基二甲氨基丙基碳二亞胺浸泡處理尼龍膜10min以活化尼龍膜，然后用蒸餾水清洗，晾干；

應用微量加樣器點2μL探針溶液于Biodyne?C尼龍膜相應位置上，反應?15min，使氨基標記的探針與尼龍膜的羧基共價結合；

再用?0.1mol/L?NaoH?處理10min，蒸餾水清洗，晾干后備用；

尼龍膜的左邊一般點野生型探針，右邊點相應位點的突變型探針。

6.根據權利要求1或2所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于：

每個反應體系取細菌基因組DNA?1?μL于?50μL?反應體系；50μL反應反應體系中含有0.2mmol/L?dNTPs，DNA模板100?ng，引物0.2?mmol/L，Taq酶1.5U，1/10體積的10×PCR緩沖液，1.5mmol/L?MgCl₂；

擴增程序：95?℃，5?min?；95?℃，1?min，56?℃，1?min，和72℃，1?min，共40個循環；最后在72℃下10?min?延伸。

7.根據權利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于：所述反向斑點雜交的方法如下：

取生物素標記的PCR擴增產物40μL加入1×?SSPE?200μL?于0.5mL?的EP管中，95℃?15?min?進行變性后，迅速放入冰中防止PCR產物復性，然后取經變性的PCR產物，加入預先放置好并預熱尼龍膜片和3ml?雜交液離心管，57℃雜交30?min；

取出膜條，移至裝有洗液并且已經經57℃預熱的離心管，57℃每次15?min洗滌兩次；

其余操作過程在室溫下進行：3mL連接液中孵育15min，然后用洗液室溫洗滌2?次，每次10?min；

再用底物緩沖液洗滌一次，然后加入3mL?底物反應液BCIP?/NBT，室溫下輕搖30?min，將膜片用水洗滌，干燥，即可見藍色斑點顯現。