[發明專利]利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白干涉的方法及其專用表達載體

有效

• 申請號: 201110270320.5
• 申請日: 2011-09-13
• 公開（公告）號: CN102311969A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 張成崗;吳永紅;張曉;葉巧;李偉光;高艷;石錦平
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;A01K67/033;G01N33/68;C12Q1/68;C12R1/19
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白干涉的專用表達載體，是含有一個或多個相同或不同蛋白轉導肽的原核表達載體。

2.根據權利要求1所述的專用表達載體，其特征在于：所述蛋白轉導肽為：TAT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)，優選為TAT。

3.根據權利要求1所述的專用表達載體，其特征在于：用于構建所述原核表達載體的出發載體可為任意一種外源基因的原核表達載體，如pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO或pQE30，優選為pET28。

4.一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白干涉的方法，是將待鑒定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入權利要求1-3任一所述專用表達載體中，將得到的原核表達載體轉化入大腸桿菌并誘導表達，得到的重組大腸桿菌喂飼正常株系秀麗線蟲，根據秀麗線蟲生物及生化指標檢測結果評估相互作用蛋白發生干涉的能力和強度。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)確定可能具有相互作用的靶蛋白并分別克隆其編碼基因；

2)將靶蛋白編碼基因分別插入所述專用表達載體中，得到含有蛋白轉導肽編碼區和靶蛋白編碼基因相融合的原核表達載體；

3)將步驟2)構建的原核表達載體轉化入大腸桿菌原核表達系統；

4)原核表達載體的誘導表達及蛋白表達水平檢測鑒定；

5)將步驟3)得到并經步驟4)鑒定的體外表達靶蛋白的重組大腸桿菌單獨或混合喂飼正常株系秀麗線蟲；

6)檢測秀麗線蟲生物及生化指標并評估靶蛋白之間發生干涉的能力和強度。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述靶蛋白可以是單個的功能蛋白，也可以是兩個或多個具有相互作用的功能蛋白；該蛋白可以是秀麗線蟲自身蛋白，也可以是其他物種中具有潛在相互作用的蛋白。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中大腸桿菌原核表達系統的宿主菌為：BL21、DH5α、HB101、JM109、OP50或耐輻射奇球菌。

8.根據權利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于：所述誘導表達為采用化學試劑誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統中表達，其中，化學試劑誘導表達條件為：誘導劑IPTG誘導表達(終濃度1mM)；誘導表達的OD₆₀₀＝0.6-1.0；誘導表達時間6-8小時；或

所述誘導表達為采用溫度誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統中表達，其中，溫度誘導表達條件可為：誘導表達的OD₆₀₀＝0.4-0.6；誘導表達溫度42℃-44℃；誘導表達時間6-8小時。

所述步驟4)中的蛋白表達水平檢測可采用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。

9.根據權利要求4至8任一所述的方法，其特征在于：所述步驟5)中喂飼秀麗線蟲的大腸桿菌需預先涂布到NGM平皿或LB平皿中；混合喂飼的比例為1∶5、1∶2、1∶1、2∶1或5∶1。

10.根據權利要求4至9任一所述的方法，其特征在于：所述步驟6)中秀麗線蟲的生物及生化指標檢測，生物指標具體包括形態結構變化和細胞水平變化等，如產卵率變化、成蟲率變化、是否出現體型變小或肥胖、是否在咽部出現空泡現象、是否出現運動行為失調等；表觀指標可通過體視顯微鏡觀察判定；生化指標具體包括靶蛋白或其調控因子表達水平檢測，如蛋白質，DNA和RNA等，其表達水平檢測可以為免疫印跡、凝膠遷移實驗和聚合酶鏈式反應等；而蛋白質干涉前后秀麗線蟲的行為變化可以通過定量行為學等技術手段進行檢測；根據秀麗線蟲在蛋白干涉前后的表型差異可分析獲得相互作用蛋白發生干涉的能力和強度。