[發(fā)明專利]基于磁珠提取馬鈴薯及其深加工產(chǎn)品核酸的方法

無效

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• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102321615A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設計）人: 趙衛(wèi)東;陳磊;鄭文杰;王愛迪;冉曉華
• 申請（專利權(quán)）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種采用磁珠從植物及其植物源加工食品中提取并純化核酸的領域。磁珠通過修飾之后可以與核酸特異性結(jié)合而從復雜的樣品中進行分離純化，通過洗脫使提取的核酸釋放到溶液中，實現(xiàn)核酸的快速分離提取，涉及核酸分離方法、試劑盒及在轉(zhuǎn)基因檢測中的應用。?

背景技術(shù)

核酸的提取與純化技術(shù)是生物化學與分子生物學的一項基本技術(shù)。隨著分子生物學技術(shù)廣泛應用于生物學，醫(yī)學，食品檢測及其相關(guān)領域，核酸的提取與純化技術(shù)也得到了進一步的發(fā)展。?

核酸在細胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，核酸提取主要是將核酸與蛋白、多糖、脂肪、酚類等生物分子物質(zhì)分離。大多數(shù)方法一般都包括細胞裂解，去除與核酸結(jié)合的物質(zhì)，沉淀核酸，去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等步驟。傳統(tǒng)方法主要是CTAB法，離心柱法，試劑盒法。由于傳統(tǒng)方法步驟繁瑣，耗時，并且用有機溶劑，污染較大，易導致核酸降解；試劑盒法存在價格昂貴等缺點。?

本發(fā)明采用磁珠核酸提取方法，在操作過程中不含氯仿，苯酚等毒性大的有機溶劑，提取純化的核酸質(zhì)量好，滿足核酸后續(xù)研究的需求，提取步驟更為簡單，不需要多次離心，易于實現(xiàn)自動化，這些優(yōu)點及其特點使其具有代替其它方法的趨勢。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是利用磁珠從馬鈴薯及其深加工產(chǎn)品中快速提取基因組DNA，以進行后續(xù)轉(zhuǎn)基因檢測。?

本發(fā)明以磁珠為固相載體純化核酸的方法包括以下步驟：?

(1)細胞裂解：使用裂解液將樣品細胞裂解，以釋放其中的核酸，并離心取其中的上清液。?

(2)核酸純化：將裂解上清液與binding?buffer混合，再加入二氧化硅殼磁珠。通過binding?buffer對于DNA的排擠作用，使得磁珠特異性地與DNA結(jié)合。磁分離之后棄去上清液，磁珠-DNA復合物得以保留，其余雜質(zhì)則除去。之后再用70％乙醇洗滌，除去殘留雜質(zhì)。?

(3)核酸洗脫：在磁珠-DNA復合物中加入TE溶液，DNA即可洗脫下來，以供后續(xù)生物檢測之用。?

本發(fā)明的優(yōu)點：?

(1)不需使用有毒的有機溶劑，綠色環(huán)保，有利于操作人員的健康。?

(2)操作簡便，大大減少核酸純化時間，操作時間小于2h，有效防止長時間操作造成的核酸降解。?

(3)使用范圍廣泛，不僅適用于含有多酚、多糖的植物鮮品，還適用于含有較多PCR抑制劑、DNA片段嚴重斷裂的深加工食品。?

(4)具有自動化升級的潛力，可與磁珠分離設備配合，實現(xiàn)核酸提取的規(guī)模化、集成化。?

附圖說明

附圖1.為2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。泳道左邊為馬鈴薯內(nèi)源UGPase基因產(chǎn)物，中間為外源35S基因產(chǎn)物，右邊為外源Nos基因產(chǎn)物。1-6號泳道檢測樣品依次為：陽性對照、薯條、薯片、薯泥和空白對照。?

附圖2.為馬鈴薯內(nèi)源基因的熒光定量PCR的檢測。?

附圖3.為馬鈴薯外源CaMV35S基因的熒光定量PCR的檢測。?

附圖4.為馬鈴薯外源NOS基因的熒光定量PCR的檢測。?

具體實施方式

實施例1：以磁珠純化馬鈴薯及其深加工產(chǎn)品的核酸。?

具體實施方式：?

以馬鈴薯及其馬鈴薯加工產(chǎn)品為例。?

1.稱取一定量的樣品于EP離心管中。?

2.加入適量的細胞裂解液，于65℃中30min，中間混勻3-4次。?

3.12000rpm離心10min?

4.取適量上清液(注意不要吸到雜質(zhì)顆粒)于已經(jīng)用binding?buffer分散好的二氧化硅-磁球中，形成DNA-二氧化硅-磁球復合物。?

5.充分混勻后靜置10min。?

6.磁分離，棄去混合溶液。?

7.重復4-6。?

8.用適量的70％乙醇溶液分散，洗去雜質(zhì)。?

9.磁分離，棄去液體。?

10.重復8-9。?

11.室溫下充分晾干。?

12.加入一定量的TE洗脫DNA，使DNA從DNA-二氧化硅-磁球復合物脫離下來。?

13.磁分離，吸取液體，即得到DNA溶液，存放于4℃冰箱中備用。?

實施例2：以磁珠純化馬鈴薯及其制品的DNA和熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分。?

按照實施例1中的具體實施方式提取DNA，并且用于內(nèi)源基因檢測以及轉(zhuǎn)基因35S，NOS成分的檢測，具體結(jié)果見附圖說明以及表一和表二。?