[發(fā)明專利]重組人促卵泡激素及其制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110269900.2
• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102295695A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金磊;劉洪霞;尉繼征;郝鵬;石欣欣;丁麗艷
• 申請（專利權(quán)）人: 長春金賽藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C07K14/59
• 分類號: C07K14/59;C12N15/85;A61K38/24;A61P15/08;C12N15/16;C12N5/10
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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及高比活性的重組人促卵泡激素和其制備方法。另外，本發(fā)明還涉及該制備方法中所用的中間體。

背景技術(shù)

促卵泡激素(FSH)是調(diào)節(jié)雌性和雄性哺乳動物(包括人類)的生殖相關(guān)功能的重要激素，可用于治療不排卵綜合癥、黃體缺陷以及不育癥等。FSH是一個異源二聚體糖蛋白，由非共價結(jié)合的α和β亞基結(jié)合而成。其中，α亞基和β亞基均為糖蛋白，各分布有2個糖基化位點(diǎn)。FSH的糖基結(jié)構(gòu)部分的存在及組分決定了其生物學(xué)功能的性能及穩(wěn)定性。而對于經(jīng)歷翻譯、剪接和折疊才得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物來說，其活性已經(jīng)難以預(yù)料，而糖基化的存在與組分為預(yù)測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的性質(zhì)帶來了更大的難度，以至于美國FDA感嘆道：“生物制品的生產(chǎn)過程就是產(chǎn)品”。

對于FSH的制備，中國專利第88103966號公開了采用免疫層析和逆相HPLC步驟從絕經(jīng)后尿促性腺激素中純化人FSH(hFSH)。此后，DNA重組制備的hFSH(rhFSH)的方法也有報道。例如，中國專利第98807811號致力于通過引入二硫鍵來穩(wěn)定FSH，而中國專利第99808813號和第200480032665號則通過引入一些突變來提高性能及穩(wěn)定性，但是這些蛋白結(jié)構(gòu)的改變將增加該突變的FSH被機(jī)體識別為異源蛋白的隱患，從而在體內(nèi)使用時帶來免疫風(fēng)險。

中國專利第200480036591號、第200580037591號、第200910048718號和第200910051483號通過后期純化步驟的優(yōu)化來提高h(yuǎn)FSH的性能及穩(wěn)定性，最終得到的高純度的FSH的比活達(dá)到12104IU/mg。

本發(fā)明人研制了不同于現(xiàn)有技術(shù)的FSH制備方法，在DNA水平上做了大幅度的優(yōu)化，但不在最終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)水平上引入突變，即最終產(chǎn)物與天然hFSH的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)相同，翻譯產(chǎn)物正確，避免了體內(nèi)用藥時的免疫風(fēng)險；另外在轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)以及后期純化中進(jìn)行了全面優(yōu)化。最終，本發(fā)明人不但獲得了表達(dá)水平高的rhFSH，更令人意想不到的是，獲得的rhFSH的活性進(jìn)一步得到了提高，比活高于現(xiàn)有技術(shù)所報道的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供不同于現(xiàn)有技術(shù)的rhFSH的制備方法，該方法獲得的最終產(chǎn)物正確，保留了FSH的生物活性。另外，本發(fā)明還提供了該方法制備而得的rhFSH以及該方法中使用的中間體。

具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了高比活性的重組促卵泡激素，其比活性大于12200IU/mg，優(yōu)選大于12300IU/mg，最優(yōu)選為12350～12400IU/mg，如12390IU/mg。重組促卵泡激素優(yōu)選是哺乳動物的重組促卵泡激素，最優(yōu)選是重組人促卵泡激素(rhFSH)，該重組人促卵泡激素包括氨基酸序列如SEQ?IDNO：2所示的FSHα亞基蛋白和氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示的FSHβ亞基蛋白。在本文中，重組表示通過DNA重組技術(shù)獲得的，而不是通過從天然來源分離提取的，例如不是從尿液中提取的。

優(yōu)選本發(fā)明第一方面的重組促卵泡激素由如下制備方法制備而得：

(1)將FSHα亞基基因和FSHβ亞基基因可操作地插入真核表達(dá)載體中，獲得能表達(dá)FSHα亞基蛋白和FSHβ亞基蛋白的轉(zhuǎn)染載體，其中，F(xiàn)SHα亞基基因包含編碼FSHα亞基蛋白的cDNA序列和上游內(nèi)含子序列，F(xiàn)SHβ亞基基因包含編碼FSHβ亞基蛋白的外顯子2、內(nèi)含子2和外顯子3序列；

(2)將轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞并培養(yǎng)；和

(3)將培養(yǎng)上清液依次經(jīng)超濾、陰離子交換層析、疏水層析、陰離子交換層析、分子排阻層析和陰離子交換層析純化。

在本文中，可操作地插入表示根據(jù)基因序列和載體序列將基因插入載體從而能夠進(jìn)行表達(dá)。通常，將基因置于啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列之間并保持閱讀框一致。

根據(jù)蛋白序列可以推導(dǎo)出大量的基因序列，但是不同基因序列的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的效率會有很大差異。盡管有基于表達(dá)宿主的密碼子使用頻率的優(yōu)化手段，但是基因序列的優(yōu)化仍舊帶有很大的經(jīng)驗(yàn)性。根據(jù)本發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)，優(yōu)選本發(fā)明第一方面中，亞基基因序列接近(或優(yōu)選等于)其天然基因序列，優(yōu)選FSHα亞基基因的多核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，和/或，F(xiàn)SHβ亞基基因的多核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。這些基因序列與現(xiàn)有報道的相應(yīng)基因序列有差異，直接來自天然狀態(tài)的基因序列，這可能是本發(fā)明的rhFSH能夠高表達(dá)的原因之一。