[發明專利]一種AKT1基因突變檢測特異性引物和液相芯片

有效

• 申請號: 201110269791.4
• 申請日: 2011-09-13
• 公開（公告）號: CN102994620A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 許嘉森;吳詩揚
• 申請（專利權）人: 廣州益善生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;曾旻輝

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種AKT1基因突變檢測特異性引物和液相芯片。

背景技術

AKT是病毒癌基因v-akt的人類同源基因，編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，在PI3K相關的信號通路中起重要的作用，影響細胞的生存、增殖和侵襲，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程。

目前研究表明，在肺癌和乳腺癌中，AKT基因激活與化療藥物抗性顯著相關，AKT1基因表達升高被認為是肺癌細胞對順鉑抗性的原因；而在乳腺癌細胞的研究中，AKT激活顯著增強其對化療藥物的抗性。此外，在超過90％的非小細胞肺癌中發現了AKT基因的持續激活且引起PI3K抑制劑和放射治療的抗性。

目前，AKT1基因的療效相關突變主要有E17K和E49K，E17K(49G＞A)突變是第17位的密碼子編碼的谷氨酸突變為賴氨酸，該突變改變了對激酶抑制劑的敏感性，而E49K(G145A)是第49位密碼子編碼的谷氨酸突變為賴氨酸，AKT1基因突變已成為藥效研究的熱點。

目前，對AKT1基因突變進行檢測和分析的方法很少，主要有直接測序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內切酶識別位點的改變，如位點丟失或產生新位點，通過PCR擴增某一特定片段，再用限制性內切酶酶切擴增產物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產生新酶切位點的基因突變檢測。再次，以上這些方法都存在著檢測通量的局限性，每次只能檢測一種突變類型，不能滿足實際應用的需要。

發明內容

本發明的目的之一是提供AKT1基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單項或者并行檢測AKT1基因兩種常見基因型E17K和E49K的野生型和突變型。

實現上述目的的技術方案如下：

一種AKT1基因突變檢測液相芯片，包括有：

(A).針對AKT1基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物：每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為：針對E17K位點的SEQ?ID?NO.5及SEQ?ID?NO.6；和/或針對E49K位點的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8；所述tag序列選自SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.4；

(B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ?ID?NO.9～SEQ?ID?NO.12，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；

(C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。

優選地，所述擴增引物為針對E17K、E49K位點的SEQ?ID?NO.13和SEQ?ID?NO.14。

優選地，所述ASPE引物為：針對E17K位點的由SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.5組成的序列及由SEQ?ID?NO.2及SEQ?ID?NO.6組成的序列；和/或針對E49K位點的由SEQ?ID?NO.3和SEQID?NO.7組成的序列及由SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.8組成的序列。

本發明的另一目的是提供用于AKT1基因突變檢測的特異性引物。

實現上述目的的技術方案如下：

用于AKT1基因突變檢測的特異性引物，其為：針對E17K位點的SEQ?ID?NO.5及SEQ?IDNO.6；和/或針對E49K位點的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8。

本發明的主要優點在于：

1.本發明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100％。且檢測所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合實際應用需要。所制備的AKT1基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，實現多個突變位點的并行檢測。