[發明專利]抗結核分枝桿菌單克隆抗體及其識別的抗原表位和用途

無效

• 申請號: 201110269165.5
• 申請日: 2011-09-13
• 公開（公告）號: CN102399751A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 劉思國;王華南;于申業;朱婷;于秀婷;劉慧芳;王秀梅;司微
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569;C07K7/06;G01N33/68;A61K39/04;A61P31/06
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及單克隆抗體，尤其涉及一種抗結核分枝桿菌CsdA單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發明還涉及與該單克隆抗體特異性結合的一個表位多肽以及它們的用途，本發明屬于抗結核分枝桿菌CsdA單克隆抗體領域。

背景技術

結核病是嚴重危害人類健康的重要傳染病，對公共衛生安全造成了極大的威脅。中國是結核病的高發國家，結核病人數居世界第二并有上升趨勢，結核病的防控不容樂觀。全球耐藥結核病的發生率上升和廣泛傳播給結核病控制工作帶來了嚴重威脅，為了尋找新的作用靶點，尤其是一些功能特殊的蛋白質(冷休克蛋白)是開發新藥物的重要途徑。

冷休克蛋白(Cold?shock?protein，CSP)是廣泛存在于革蘭氏陽性菌和陰性菌中的應激蛋白，在保護機體和幫助細胞適應低溫環境方面起著重要的作用。CSP是RNA分子伴侶，其與細胞中的mRNA結合，穩定mRNA，調節蛋白質的表達。在某些病原菌中，CSPs對于其致病、傳播以及應對宿主免疫系統等起著重要的作用。有研究表明，CSP與生物被膜的形成有關，生物被膜對于許多致病菌(如銅綠假單胞菌等)的致病有著重要的作用，還發現冷休克蛋白是細菌低溫存活的關鍵蛋白，因而深入研究結核分枝桿菌冷休克蛋白的功能，能為抑制結核分枝桿菌生長提供新思路，并探索其與結核分枝桿菌致病和免疫方面的關系，可以便于尋找特異菌體抗原的靶向藥物從而實現結核病的預防與治療。

Dead-box蛋白家族屬于冷休克蛋白家族中的一類蛋白，CsdA(cold-shock?DEAD-box?protein?A)屬于Dead-box蛋白家族非常重要的一個蛋白，常溫下表達量極低，而在低溫時會大量表達，具有RNA酶解旋活性，是核糖體結合蛋白，其功能與細胞分裂增殖有關。目前，最常用的方法是應用基因敲除或者RNA干擾技術研究CsdA蛋白在結核分枝桿菌內的作用機理，那么能否成功敲除CsdA基因或者RNAi成功，需要抗結核分枝桿菌CsdA單克隆抗體進行驗證，迄今為止，尚缺乏一種抗結核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體。因此，制備抗CsdA單克隆抗體對于研究結核分枝桿菌的低溫存活機制具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的之一是提供一株分泌抗結核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

本發明的目的之二是提供一種抗結核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體以及與該單克隆抗體特異性結合的一個表位多肽。

本發明目的之三是提供所述單克隆抗體以及與該單克隆抗體特異性結合CsdA的表位多肽的用途。

本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的：

一株穩定分泌抗結核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株(A3G5)，其微生物保藏號是：CGMCC?No.5077；保藏時間為2011年7月22日；其分類命名是：雜交瘤細胞株；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

所述雜交瘤細胞株通過以下途徑制備得到：用CsdA-his融合蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫的小鼠脾臟細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞經融合、篩選、克隆、傳代和反復凍存、復蘇后獲得小鼠雜交瘤細胞系，最終篩選出一株能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株A3G5。本發明進一步從雜交瘤細胞上清液中或從注射雜交瘤細胞的動物腹水中，獲得結核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體。

所述CsdA-his融合蛋白由以下方法獲得：將含有結核分枝桿菌CsdA核苷酸序列的pET28a-CsdA質粒載體轉化大腸桿菌，IPTG誘導下獲得低尿素濃度可溶的CsdA-his融合蛋白，對CsdA-his融合蛋白進行純化，得到所述的CsdA-his融合蛋白。

本發明所述的IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，異丙基-β-D硫代半乳糖苷)可以誘導蛋白表達，能對乳糖操縱子產生極強的誘導效應，是強誘導物。

具體的，所述單克隆抗體由如下方法制備得到：

(1)免疫原的準備：將pET-28a-CsdA載體轉化DE3大腸桿菌，在IPTG誘導下，分子量約64ku的CsdA以低尿素濃度可溶的形式存在。在本發明的一個優選實驗方案中，以低尿素濃度、加入去垢劑和咪唑梯度洗脫對融合蛋白進行了純化，并以純化過的蛋白作為抗原免疫小鼠；

(2)動物免疫：用上述純化過的CsdA融合蛋白免疫BALB/c小鼠。每只小鼠以100ug的量進行背部皮下注射，每兩周一次共三次，第四次加強免疫一次，3天后待融合，獲得免疫小鼠。