[發明專利]人殘耳軟骨干細胞及其構建組織工程軟骨的方法

有效

• 申請號: 201110268830.9
• 申請日: 2011-09-13
• 公開（公告）號: CN102989040A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 周廣東;劉豫;曹誼林;劉偉
• 申請（專利權）人: 上海國睿生命科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張睿

技術領域

本發明涉及醫學和生物醫學工程領域，更具體地涉及利用人殘耳軟骨干細胞構建的組織工程化軟骨及其制備方法和用途。

背景技術

小耳畸形(microtia)是一種發病率較高(約1/3000)的先天性疾病，表現為耳廓標志形態缺失，耳區被攣縮、畸形的軟骨團塊(殘耳軟骨)所取代。目前臨床上對小耳畸形的治療主要是取患者自體肋軟骨雕刻成耳廓形態后植入耳區皮下為主。該方法的主要缺點是對正常肋軟骨造成很大創傷，而且容易導致氣胸、胸廓塌陷、畸形和瘢痕等供區并發癥。

組織工程技術的興起及迅速發展為解決這一難題帶來了希望。目前應用動物的軟骨細胞復合耳廓形態可降解支架已能在體外構建出精確的人耳廓形態軟骨。因此，只要有足夠的病人自體來源的軟骨構建種子細胞，這一技術完全有希望轉化為實際的臨床應用，為小耳畸形患者的外耳重建帶來福音。

然而，種子細胞來源問題一直是制約這一技術向臨床轉化的瓶頸。目前用于構建軟骨的種子細胞主要有兩種：1)軟骨細胞；2)具有軟骨分化潛能的干細胞。由于軟骨細胞本身已經具有很強的自發成軟骨能力，因此直接用其構建組織工程軟骨最穩定也最能保證成功率；但正常人體內的軟骨細胞來源非常有限，取材創傷大，且正常軟骨細胞體外擴增能力很低，擴增后又極易老化、去分化，從而喪失軟骨形成能力，因此，取病人自體正常軟骨細胞進行外耳軟骨重建缺乏臨床應用可行性。具有成軟骨分化潛能的干細胞(如脂肪干細胞或骨髓基質干細胞)雖然來源廣泛，擴增能力強，但這些細胞體外構建具有特定形態(如人耳廓)軟骨的成功率不高，且體外構建的軟骨植入皮下環境后很不穩定，極易發生骨化或纖維化，也不適于構建耳廓等異位軟骨。

小耳畸形患者的殘耳在外耳再造手術中屬于廢棄組織，切取殘耳不會對正常組織造成任何損傷，并且已有研究證實：早期傳代的殘耳軟骨細胞能夠再生組織工程軟骨。那么，能否利用小耳畸形病人自體的殘耳軟骨細胞構建耳廓形態軟骨來進行耳再造呢？要實現這一夢想，首先要解決三個關鍵問題：1.細胞數量問題：一個病人的殘耳軟骨中僅能分離獲得1-3×10⁶個細胞，能否將這些細胞擴增到構建正常大小人耳廓形態軟骨所需的細胞數量(1.5-3×10⁸個細胞)？2.細胞功能問題：擴增后的殘耳軟骨細胞是否還具有良好的軟骨形成能力？3.構建技術問題：如何利用這些細胞在體外構建具有精確人耳廓形態的軟骨？

綜上所述，本領域迫切需要尋找取材創傷小，具有較強增殖能力和軟骨形成能力，且在皮下環境中軟骨形成穩定的種子細胞，并建立相應的軟骨構建核心技術。

發明內容

本發明旨在提供一種增殖能力強、軟骨定向分化潛能強、且在體外及皮下環境中軟骨形成穩定的軟骨再生種子細胞(殘耳軟骨干細胞)，以及利用該細胞構建組織工程三維軟骨移植物的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種組織工程化軟骨移植物，所述的移植物含有在三維結構下生長的人殘耳軟骨細胞；所述的人殘耳軟骨細胞是第1、2、3、4、5、6、7、或8代傳代的；較佳地，是第1、2、3、4、或5代的。

在另一優選例中，所述三維結構是由所述的人殘耳軟骨細胞聚集形成的團塊(pellet)、或高密度所述人殘耳軟骨細胞接種于培養皿所形成的細胞膜片、或是由所述人殘耳軟骨細胞接種于固體的醫學上可接受的生物可降解材料形成；所述高密度是指0.5×10⁶個細胞/cm²-5×10⁶個細胞/cm²；所述醫學上可接受的生物可降解材料選自：聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對二氧六環酮、膠原、明膠、透明質酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細胞基質，及其共聚物或混合物。

在本發明提供的軟骨移植物中，所述的人殘耳軟骨細胞來自自體或同種異體；優選小耳畸形(microtia)患者自體的殘耳軟骨。

本發明提供的軟骨移植物，以所述移植物的總體積計，其中的人殘耳軟骨細胞濃度為2×10⁷個細胞/cm³-10×10⁷個細胞/cm³；較佳地，為2×10⁷個細胞/cm³-7×10⁷個細胞/cm³。