[發明專利]惡性瘧原蟲pfs25蛋白突變體及其酵母表達方法

有效

• 申請號: 201110267829.4
• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102286089A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 陳勇;蔣琳;雷清;楊軍;高雪峰;應連芳;劉曉
• 申請（專利權）人: 蘭州生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C07K14/445
• 分類號: C07K14/445;C12N15/30;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海翰鴻律師事務所 31246
• 代理人: 李佳銘

技術領域

本發明屬于傳染病防治領域，具體涉及瘧疾的防治，尤其涉及用于傳播阻斷型惡性瘧疾疫苗的候選靶抗原。

背景技術

瘧疾是世界上分布和流行最廣的寄生蟲性疾病之一，世界上有20億人口生活在疫區。每年全球大約有3億人口患病，其中50％是由惡性瘧疾原蟲引起的，5歲以下兒童患病人數約為250萬，每年死于瘧疾的人口約100萬-300萬。我國瘧疾每年患病人數為10萬左右。近年來，隨著抗藥瘧原蟲(瘧疾病原體)和抗藥按蚊(傳播媒介)的出現，瘧疾的防治面臨更大的挑戰。

瘧原蟲生活史復雜，包括有性、無性兩個階段三個時期，即在有性階段的配子期和無性階段的細胞前期及紅細胞內期。由于瘧原蟲抗原在各個時期不同，抗原性較弱且有多個抗原表位，加之瘧原蟲的致病機理尚不十分清晰，這些因素給瘧疾疫苗的研究帶來了極大的困難。

對瘧原蟲抗原的研究，人們發現某些特異性抗原，有望成為瘧疾疫苗的侯選物。其中一些重要抗原，如在子孢子表面表達的環子孢子蛋白(CSP)、在肝和血兩個時期表達的裂殖子表面蛋白(MSP)、在有性階段表達的合子表面或動合子表面抗原(Pfs25)等，已經作為瘧疾候選疫苗的保護性抗原，并取得了初步的成果。

1988年Kaslow?DC等首次報道了位于合子或動合子表面膜蛋白的Pfs25蛋白質，結果表明該蛋白質由217個氨基酸組成，富含半胱氨酸，其分子特征是存在四個“EGF樣的結構域”(Nature.1988May?5；333(6168)：74-6.)。1991年BarrPJ等報道了重組Pfs25蛋白作為傳播阻斷型疫苗在試驗動物上的效果(The?Journal?of?experimental?medicine.1991Nov?1；174(5)：1203-8.)。KaslowDC等在美國專利US5217898公開了酵母表達Pfs25突變體的方法，該突變體稱為Pfs25B，由相當于Pfs25天然序列22-188位的氨基酸組成，其中相當于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替換成丙氨酸。2003年Zou?L等報道在畢赤酵母中表達pfs25蛋白質突變體，該突變體相當于Pfs25天然序列23-193位的氨基酸組成，其中相當于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替換成谷氨酰胺(Vaccine.2003Apr2；21(15)：1650-7.)。盡管上述兩種突變體在動物體內表現出傳播阻斷作用，并進行了I期臨床安全性研究，但在進一步開發中都存在問題。因此本領域迫切需要研制有效的藥物或疫苗來防治這種疾病。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種新的惡性瘧原蟲Pfs25蛋白突變體，作為傳播阻斷疫苗的候選抗原。本發明要解決的另一問題是提供一種高效、經濟的酵母表達Pfs25蛋白突變體的方法。

本發明的第一方面，提供了一種惡性瘧原蟲Pfs25蛋白突變體，該突變體相當于Pfs25天然蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187的天冬酰胺突變為谷氨酸，具體見SEQ1。

本發明的第二方面，提供了一種采用酵母偏愛密碼子的編碼Pfs25蛋白突變體的核苷酸序列，具體見SEQ2。

本發明的第三方面，提供了一種在畢赤酵母中表達Pfs25蛋白突變體的方法，包括如下步驟：

(1)將Pfs25蛋白突變體編碼基因置于三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子的下游，構建重組酵母菌；

(2)以YPD培養基培養重組酵母菌；

(3)補加葡萄糖維持發酵液中的葡萄糖終濃度在0.5～1g/L范圍；

(4)培養24～72小時，收獲培養上清，提取目的蛋白。

其中所述的Pfs25蛋白突變體是指相當于Pfs25天然蛋白第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸替換。更優選的，相當于Pfs25天然蛋白第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸替換。最優選的，Pfs25蛋白突變體是SEQ1定義的突變體。

在一個優選的方案中，Pfs25重組酵母菌在29.0℃、pH6.0～4.0、溶氧＞20％、條件下發酵培養。

在更優選的方案中，發酵過程中發酵過程中轉速約350rpm，保持通氣速度200L/h(壓縮氣體)。

在更優選的方案中，發酵液中加入Antifoam?204作為消泡劑。

本發明的惡性瘧原蟲Pfs25蛋白突變體(簡稱Pfs25-3E)，能夠與針對Pfs25標準蛋白的單克隆抗體4B7特異性反應，用于小鼠免疫，能夠誘導產生高滴度的抗Pfs25抗體，是一種可用于阻斷傳播疫苗研制的良好的候選抗原。