[發明專利]卵巢癌原發化療敏感性測評試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201110266041.1
• 申請日: 2011-09-08
• 公開（公告）號: CN102435734A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 崔世英;丁艷芳;趙瑾瑤;楊亮;畢麗華;姜繼勇
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉曉琴

1.卵巢癌原發化療敏感性測評試劑盒，其特征在于該試劑盒包括：由5％山羊血清、1％BSA、0.01％聚乙二醇辛基苯基醚和pH7.4的磷酸緩沖液組成的封閉液，由ERCC2抗體、生物素化二抗工作液和封閉液組成的抗原抗體反應系統，由辣根酶標記鏈霉卵白素工作液和DAB試劑緩沖液組成的抗生物素蛋白-氧化物酶反應系統，以及作為復染劑的蘇木精。

2.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括由0.01M檸檬酸鹽緩沖液和磷酸緩沖液組成的抗原修復系統，以及由3％過氧化氫和磷酸緩沖液組成的消除內源性過氧化物酶系統。

3.測評卵巢癌組織樣品對原發化療藥物敏感性的方法，其特征在于使用權利要求1所述的試劑盒，包括如下步驟：使用封閉液處理待測樣品后，分別使用ERCC2抗體和生物素化二抗工作液進行一抗和二抗反應，然后使用辣根酶標記鏈霉卵白素工作液處理樣品，最后進行DAB顯色和蘇木精復染；

根據樣品染色情況判定對化療藥物的敏感性：呈褐色陽性反應的樣品判定為對原發化療藥物敏感的卵巢癌組織；呈蘭色陰性反應的樣品判定為對原發化療藥物耐受的卵巢癌組織。

4.權利要求3所述的方法，包括如下步驟：

①封閉：在待處理樣品的組織上加200μl封閉液，室溫孵育60分鐘；

②抗原抗體反應：

(1)一抗孵育：在組織上加150μl按照1∶100比例稀釋的ERCC2抗體，以封口膜覆蓋組織，于4℃孵育過夜，然后以PBS清洗3次，每次10分鐘；

設陰性對照組，用同體積封閉液代替ERCC2抗體；

(2)二抗孵育：在組織上加150μl生物素化二抗工作液，室溫孵育60分鐘，PBS清洗3次，每次10分鐘；

③在組織上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫孵育60分鐘，PBS清洗3次，每次10分鐘；

④DAB顯色：

(1)制備底物混合液：在1ml?pH值＝7.0的雙蒸水中，加入一滴試劑A，混合均勻后，將試劑B和試劑C各一滴加入其中，混合均勻得底物混合液；

(2)顯色：將150μl底物混合液滴加在組織上，室溫顯色3～10分鐘，充分顯色后自來水沖洗終止反應；

⑤染色、脫水、透明、封片：將組織切片浸入蘇木精染液2次，每次2秒；然后用蒸餾水處理3次，每次5分鐘；再依次以50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇各處理1次，每次1分鐘；再以無水乙醇處理2次，每次2分鐘，二甲苯與無水乙醇1∶1混合物處理1次，2分鐘，100％二甲苯處理2次，每次2分鐘；最后用樹膠封片，保存；

⑥根據樣品染色情況判定對化療藥物的敏感性：呈褐色陽性反應的樣品判定為對原發化療藥物敏感的卵巢癌組織；呈蘭色陰性反應的樣品判定為對原發化療藥物耐受的卵巢癌組織。

5.權利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法應用于卵巢癌福爾馬林固定石蠟包埋組織的測評時，還包括對樣品的預處理步驟：

a.脫蠟：卵巢癌福爾馬林固定石蠟包埋組織常規切片，厚度4～5μm的石蠟組織切片依次經過100％二甲苯脫蠟3次，每次5分鐘；無水乙醇脫蠟3次，每次2分鐘；95％乙醇、90％乙醇、70％乙醇、50％乙醇各脫蠟1次，2分鐘；

b.抗原修復：以0.01M檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，然后以PBS清洗3次，每次5分鐘；

c.消除內源性過氧化物酶：將組織切片置于3％過氧化氫中，室溫孵育30分鐘，用PBS清洗3次，每次5分鐘。

6.篩選對原發化療藥物敏感的卵巢癌患者的方法，其特征在于使用權利要求1所述的試劑盒，包括如下步驟：以卵巢癌患者離體腫瘤組織為檢測樣品，使用封閉液處理待測樣品后，分別使用ERCC2抗體和生物素化二抗工作液進行一抗和二抗反應，然后使用辣根酶標記鏈霉卵白素工作液處理樣品，最后進行DAB顯色和蘇木精復染；

根據樣品染色情況判定樣品來源的卵巢癌患者對原發化療藥物敏感性：呈褐色陽性反應的樣品判定為對原發化療藥物敏感的卵巢癌組織，樣品來源的卵巢癌患者對原發化療藥物敏感；呈蘭色陰性反應的樣品判定為對原發化療藥物耐受的卵巢癌組織，樣品來源的卵巢癌患者對原發化療藥物耐受。

7.權利要求3～6中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述的原發化療藥物是順鉑、紫杉醇或二者的組合。

8.權利要求3～6中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述的卵巢癌是漿液性卵巢癌。