[發明專利]制備轉基因動物的新方法

無效

• 申請號: 201110265541.3
• 申請日: 2011-09-08
• 公開（公告）號: CN102415355A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 苗向陽
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;A61D19/02;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明涉及一種制備轉基因動物的新方法。具體而言，將含有外源基因的真核表達載體，制備成轉染液。采用卵泡及卵巢注射法將轉染液注射到雌性哺乳動物的成熟卵泡及卵巢中，在雌性哺乳動物發情時進行人工受精，得到子代轉基因綿羊。

背景技術

轉基因技術是近年來研究最熱門、發展最快的領域之一。所謂轉基因動物就是指用試驗的方法將人們所需要的外源基因導入到動物體內，使這種外源基因與動物本身的染色體整合在一起，這樣外源基因就能隨著細胞的分裂而增殖，在動物體內得到表達，并且能夠穩定遺傳給后代的動物。

1976年，Jaenisch首次利用反轉錄病毒感染胚胎的方法獲得了轉基因小鼠[Jaenisch?R.Germ?line?integration?and?Mendelian?transmission?of?exogenous?Monloney?leukemia?virus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1976，(73)：1260.]。1980年Gordon等人采用受精卵原核顯微注射的方法，將外源基因導入小鼠受精卵，獲得了轉基因小鼠[Gordon?J?W，et?al.Genetic?transformation?of?mouse?embryos?by?microinjection?of?purified?DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1980，77(12)：7380-7384.]。1997年，克隆羊Dolly的誕生[Wilmut?I，Schnieke?AE，McWhir?J，et?al.Viable?offspring?derived?from?fetal?and?adult?mammalian?cells.Nature，1997，385(6619)：810-813.]，開創了哺乳動物體細胞核移植技術的先河，隨后乳腺中表達人凝血因子IX的轉基因克隆羊Polly培育成功。2005年抗乳房炎轉基因牛的誕生，標志著轉基因動物育種進入了新的發展歷程，轉基因動物技術自從誕生以來就在改良家畜生產性狀、提高家畜抗病力以及生產非常規畜牧產品(如人藥用蛋白和工業用酶)等方面顯示了廣闊的應用前景。隨著基因工程技術的不斷發展，轉基因動物技術將會不斷得到完善，從而在未來的動物育種中將發揮巨大的作用。

生產轉基因動物的常用方法有：原核期胚胎顯微注射法、胚胎干細胞介導法、精子介導法、慢病毒載體法等。

原核內顯微注射是由美國人Gordon發明的，是發展最早、目前應用最廣泛的方法之一。這種方法的優點是外源基因易整合入染色體，導入的基因大，可使用任何載體承載基因片段，也可注射無載體的基因片段，外源基因的長度可達100kb，實驗周期相對比較短。其缺點是：由于基因整體進入染色體的隨機性，使外源基因整合位點和拷貝數無法控制，外源基因隨機整合到基因組內常導致宿主DNA中的染色體序列丟失、重排、插入、突變，有的甚至造成嚴重生理缺陷，而且設備昂貴、操作復雜。該方法的外源基因轉移整合率較低，如：小鼠為6％～10％，豬和羊分別為0.98％和1％。

胚胎干細胞是早期胚胎的內細胞團或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性，具有全能性，在一定條件下可發育成完整個體。因此，把外源基因導入干細胞后，經過選擇，再把陽性細胞注入另一胚胎囊胚腔中，或與另一胚胎卵裂球聚合，再經過選育即可得到轉基因動物。在轉基因領域，胚胎干細胞是公認的研究基因轉移、基因定點整合極有前途的實驗材料，利用這種方法制作轉基因小鼠的陽性率接近100％，遺憾的是第一代一般是嵌合體，要通過雜交繁育才能得到純合目的基因的個體。另外截至目前世界范圍內只有小鼠干細胞的建系方法比較成熟，大鼠、兔、豬、牛的胚胎干細胞系雖有建立，卻尚未得到應用。