[發明專利]小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗

有效

• 申請號: 201110265443.X
• 申請日: 2008-10-08
• 公開（公告）號: CN102302774A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 步志高;陳偉業;胡森
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/275
• 分類號: A61K39/275;C12N15/09;C12N15/39;A61P31/20
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

本申請是申請號為200810166154.2的發明申請的分案申請，母案的申請日為2008年10月8日，發明名稱為“小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗”。

技術領域

本發明涉及重組病毒疫苗領域，更具體地涉及小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗。本發明還涉及所述疫苗的制備方法及其應用。本發明利用我國自行培育并得到廣泛應用的GPV弱毒株，分別構建了表達PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，分別命名為GPV-PPRV-F(CGMCC?No.2621)和GPV-PPRV-H(CGMCC?No.2619)，并對其免疫效力進行了初步評估。

背景技術

小反芻獸疫(Peste?des?petits?of?ruminants，PPR)和山羊痘(Goat?pox，GP)為分別由小反芻獸疫病毒(peste?des?petits?of?ruminants?virus，PPRV)和山羊痘病毒(Goat?pox?virus，GPV)引起的危害山羊、綿羊等小反芻動物的兩種重大疫病，均為OIE發布A類烈性傳染病。PPR長期以來一直在非洲、中東、中亞、南亞及東南亞地區危害流行，2007年傳入我國西部邊境地區，導致局部疫情，對我國的畜牧養殖業形成嚴重威脅。GP多年來在我國局部地區表現為地方流行性，給我國養羊業造成一定危害。我國山羊和綿羊的飼養量數以億計，PPR和GP這兩種烈性傳染病的防控意義重大。

PPRV屬副粘病毒科麻疹病毒屬成員，與牛瘟病毒(Rinderpest?virus，RPV)同屬，基因組進化與抗原性關系密切，具有共同的中和抗體表位。病毒囊膜表面的融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)為PPRV誘導中和抗體形成的主要免疫原。

GPV為正痘病毒科GPTV屬成員。GPV弱毒疫苗預防GP安全有效。采用GP弱毒疫苗為載體構建PPR-GP重組二聯活疫苗，可同時預防GP、綿羊痘和PPR，實現一種活毒疫苗預防多種烈性傳染病，具有極為突出的優點。

山羊痘病毒基因組龐大，遺傳穩定，其胸苷激酶(TK)基因編碼區為復制非必需區，可允許大容量的外源基因插入和表達；GPV感染宿主譜狹窄，僅局限于牛羊等反芻獸；GP弱毒疫苗生產成本低廉，儲運無需冷凍、使用方便；尤其重要的，利用重組表達除血凝素蛋白和融合蛋白以外的蛋白為抗原，小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗免疫反應可以很方便地與PPRV野毒感染相區別，不干擾血清學監測，克服了現有PPR弱毒疫苗的重大缺陷，對我國廣大內地非疫區極為重要。

發明內容

本發明的一個目的是提供小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗。本發明利用我國自行培育并得到廣泛應用的GPV弱毒株，分別構建了表達PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，分別命名為GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H，分別于2008年7月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國北京朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，100101)，保藏登記號分別為：CGMCC?No.2621和2619，并對其免疫效力進行了初步評估。

本發明的另一個目的是提供所述疫苗的制備方法。

按照本發明的一些實施方案，提供了本發明的小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗的制備方法，其包括下述步驟：

(1)采用適當的引物，通過常規RT-PCR從PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)的基因組RNA分別擴增基因PPRV血凝素蛋白H基因和PPRV融合蛋白F基因；

(2)通過基因重組技術，分別構建表達PPRV融合蛋白F的pTK-gig-PPRV-F重組載體和表達PPRV血凝素蛋白H的pTK-gig-PPRV-H重組載體；

(3)將步驟(2)中的重組載體分別轉染感染了GPV病毒液的細胞，通過在熒光倒置顯微鏡下監測綠色熒光而判斷轉染是否成功，轉染成功后，表達PPRV-F和H蛋白的重組病毒載體與GPV病毒基因組的同源基因發生了同源重組，然后利用gpt和eGFP純化篩選重組病毒克隆；和

(4)鑒定已經純化的重組山羊痘病毒DNA，分別命名為GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H；

其中步驟(3)中所用的細胞是原代山羊睪丸細胞，即LT細胞。