[發明專利]一種不含活菌的蘇云金芽孢桿菌基因工程殺蟲劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201110265289.6
• 申請日: 2011-09-08
• 公開（公告）號: CN102321608A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 龐義;孫士鋒;孫釩;袁美妗;李廣宏;楊凱;鐘鎮芳
• 申請（專利權）人: 中山大學;惠州海納糧油食品有限公司
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;A01N63/02;A01P7/04;C12R1/07
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于蘇云金芽孢桿菌基因工程菌安全應用領域，涉及蘇云金芽孢桿菌工程菌及其制劑的處理方法，及由該方法所獲得的產品。?

背景介紹

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌。大部分菌株在芽孢化期間產生一種或多種伴孢晶體，這些晶體由殺蟲晶體蛋白(Insecticidal?Crystal?Proteins，簡稱ICPs)組成，殺蟲晶體蛋白為殺蟲的主要成分。伴孢晶體被目標害蟲吞食后，ICPs在消化道中被降解為具有殺蟲活性的小分子多肽，再與中腸上皮細胞BBMV(Brush?border?membrane?vesicles)上的受體結合，造成細胞膜形成孔道、上皮細胞滲透壓破壞及細胞溶解，最終導致細胞死亡(龍綮新、龐義，1994)，不同來源的Bt菌株的ICPs其殺蟲譜不同，但作用機理基本相同。蘇云金桿菌制劑目前世界上應用最廣泛，使用面積最大的一類微生物殺蟲劑，其應用量占整個生物殺蟲劑的90％。但是由于Bt存在殺蟲譜比較窄，只能對一種或幾種害蟲有效，且目前發現一些害蟲對Bt產生了抗藥性，限制了Bt的應用于推廣。為了解決Bt使用過程中出現的一些問題，提高ICPs的殺蟲毒力同時避免害蟲抗藥性的產生等問題，構建高效Bt工程菌已經成為Bt的研究熱點，2001年龐義研究小組利用Tn917轉座子通過轉座作用成功地將來源于以色列亞種Bti的兩個殺蚊蛋白基因整合到庫斯塔克亞種Btk染色體中，成功構建了既殺鱗翅目昆蟲又殺雙翅目昆蟲的高效穩定的Bt工程菌株TnY和高效專性殺蚊幼蟲的工程菌株TnX(Yu?et?al.，2001)，并獲得中國發明授權專利。其中TnX比現有商品化的以色列亞種4Q2的殺蟲毒力高1.82倍，因此極具商品化潛力。?

雖然通過基因工程的方法構建的Bt工程菌，在殺蟲毒力、晶體蛋白產量、擴大殺蟲譜等方面都有不同程度的提高，但工程菌釋放到環境之前必須確保工程菌株對環境是安全的。通常那些通過基因工程手段構建的高毒力Bt工程菌株，構建過程中常含有抗性篩選標記如紅霉素抗性基因Em等，使得這些工程菌制劑在生產、注冊和應用上受到限制。抗生素抗性致病細菌的出現引發生物安全問題受到人們的關注，具有抗性的微生物一旦進入環境就很難回收及控制，且可能會與親緣性相近的微生物之間進行基因間水平轉移(horizontal?gene?transfer，HGT)，基因水平轉移是微生物之間擁有抗生素抗性基因的主要機理，并且已?經證明抗生素抗性基因已經發生在非病原菌、病原菌之間，甚至相關的微生物之間，諸如革蘭氏陽性菌和陰性菌之間都有可能發生，因此一些致病的微生物具有抗生素抗性基因，進一步增加了風險評估的復雜性。?

蘇云金芽孢桿菌和與人類相關的致病菌炭疽桿菌(Bacillus?anthracis)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)同屬親緣較近的芽孢桿菌類(Rasko?et?al.2005)，Bt的最大區別在于芽孢分化期能夠產生伴孢晶體，而伴孢晶體早已證明是安全的，所以Bt可以作為生物農藥用于田間。為了能夠保證將Bt工程菌釋放到環境中是安全的，國內外學者已經嘗試各種各樣的方法。?

1990年，美國Mycogen公司發明了一種生物囊技術，將攜帶ICP基因的質粒導入熒光假單胞桿菌，發酵后通過物理和化學的方法致死菌體，形成帶有殺蟲晶體蛋白的死菌體包囊系統。另外，2005年，Gunjan?Pandey提出采用自殺式基因工程菌，但很難找到合適的基因，且有可能造成Bt工程菌的毒力下降。眾所周知，蘇云金芽孢桿菌中的主要殺蟲成分為ICPs，而芽孢是為了抵御不良的環境條件所必須的，只要芽孢失活，Bt就不能存活。為此，通過殺死基因工程菌中的芽孢就可以保證釋放到環境中的Bt是安全的。?

1993年崔云龍、邵宗澤用優氯凈(二氯異氰尿酸鈉)、紫外線處理蘇云金芽孢桿菌試圖滅活芽孢，但同時也使得晶體蛋白難溶于昆蟲胃液或堿液，毒力顯著下降。1996年，申繼忠提出雙氧水能夠使伴孢晶體蛋白的一級結構受到破壞，但同時毒力片段數量減少。2002年，Becker提出采用Co⁶⁰γ-射線處理蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bacillus?thuringiensis?israelensis)，在20KGY的輻射劑量時，可以全部殺死芽孢，但對伊蚊幼蟲殺蟲毒力下降20～30％(Becker，2002)，而我們采用動態Co⁶⁰γ-射線輻照的方法來分別處理工程菌株TnY(Yu，Pang?et?al.，2001)，殺蟲毒力并不下降，通過統計學分析，輻射處理前后殺蟲毒力無顯著性差異。?

發明內容