[發(fā)明專利]蘋果酸酶突變體及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110264794.9
• 申請日: 2011-09-07
• 公開（公告）號: CN102311943A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫際賓;劉嬌;鄭平
• 申請（專利權(quán)）人: 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/63;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于代謝工程和酶的定向進化領(lǐng)域，具體涉及一種蘋果酸酶突變體及其應(yīng)用，即利用代謝工程改造的重組大腸桿菌定向進化蘋果酸酶，并將獲得的定向進化蘋果酸酶用于提高大腸桿菌琥珀酸的產(chǎn)量。?

背景技術(shù)

蘋果酸酶催化可逆反應(yīng)：?蘋果酸酶在中央代謝途徑的三碳(C3)和四碳(C4)化合物的相互轉(zhuǎn)換過程中扮演著重要的角色，是固定CO₂的C4回補途徑的重要一員。與其它二氧化碳固定C4回補途徑相比，蘋果酸酶催化的反應(yīng)途徑具有明顯的能量經(jīng)濟性，對研究生命碳循環(huán)、發(fā)展碳負性工業(yè)過程有著重要的意義。?

微生物的固碳C4回補途徑，主要包括由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PepC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PepCK)、丙酮酸羧化酶(Pyc)、和蘋果酸酶(Mae)等催化的四條途徑。蘋果酸酶Mae催化丙酮酸羧化固定CO₂實現(xiàn)C4回補，從磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)開始計算可以凈產(chǎn)生一個ATP，最大限度的回收了能量供細胞使用，因此具有能量經(jīng)濟性。同時，該反應(yīng)不與大腸桿菌中主要的糖運輸途徑PTS系統(tǒng)競爭PEP(其底物之一是丙酮酸)，因此該反應(yīng)具有明顯的代謝循環(huán)優(yōu)勢。而其它幾個C4回補酶都有各自的不足：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO₃^-反應(yīng)生成草酰乙酸和磷酸，沒有ATP的產(chǎn)生；磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化PEP羧化生成草酰乙酸并凈產(chǎn)生一個ATP，但是，該反應(yīng)依賴于高濃度的PEP，與主要葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)PTS系統(tǒng)消耗PEP相矛盾；丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸，并消耗一個ATP，從PEP開始計算相當于沒有凈能量的產(chǎn)生，且該酶在大腸桿菌等一些微生物中不存在。因此，如何提高發(fā)酵菌中蘋果酸酶Mae的含量或效率就成為研究的一個重要方面。?

例如，Stols?L等利用pTRC99a質(zhì)粒載體在一個大腸桿菌突變株中過表達MaeA，通過色譜柱純化了該酶，并且分別在Mn²⁺和Mg²⁺存在下測定了其對丙酮酸和蘋果酸的Km值，發(fā)現(xiàn)Mn²⁺是更好的激活金屬離子。1mM的Mn²⁺存在下，該酶對丙酮酸的Km值為16mM，而對蘋果酸的Km值為0.26mM(Stols?and?Donnelly?1997)。Jinxia?Wang等也表達純化了大腸桿菌的MaeA，在最適pH7.2條件下測定了蘋果酸和NAD⁺的Km值，分別為0.42mM和0.097mM，并且發(fā)現(xiàn)高濃度的底物蘋果酸和NAD+都對脫羧反應(yīng)酶活具有抑制作用(Wang，Tan?et?al.2007)。Federico?P.Bologna等研究大腸桿菌的MaeA時發(fā)現(xiàn)其催化脫羧反應(yīng)的效?率約是羧化反應(yīng)的30倍，而且發(fā)現(xiàn)脫羧反應(yīng)的最適pH為7.5，而羧化反應(yīng)的最適pH為7.0，該酶對蘋果酸和丙酮酸的Km值分別為0.66mM和2.59mM(Bologna，Andreo?et?al.2007)。?

盡管酶的動力學研究表明在生理條件下蘋果酸酶傾向催化蘋果酸脫羧反應(yīng)；但羧化反應(yīng)的標準自由能變化為-2kcal/mol，所以熱力學應(yīng)該更有利于羧化反應(yīng)的進行。已有研究表明在生物體內(nèi)蘋果酸酶可以催化丙酮酸羧化反應(yīng)，參與C4回補途徑。Stols等人報道在丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶雙突變的大腸桿菌NZN111菌株中過表達大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶，解決了原菌株在厭氧條件下丙酮酸過量積累造成的細胞毒性問題。Zelle等人在丙酮酸羧化酶缺陷的釀酒酵母中過表達大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶，獲得了更高ATP產(chǎn)量的葡萄糖厭氧發(fā)酵菌株，證實了蘋果酸酶催化的逆反應(yīng)替代丙酮酸羧化酶發(fā)揮C4回補功能和有助于ATP積累的優(yōu)勢(Zelle，Harrison?et?al.2011)。現(xiàn)有的研究表明大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶可以發(fā)揮C4回補功能。因此，改造蘋果酸酶的催化性能，強化蘋果酸酶的表達，將之應(yīng)用于代謝工程改造微生物，可望構(gòu)建出具有高效C4回補途徑的工程菌株。?

發(fā)明目的?

本發(fā)明的目的在提供一種蘋果酸酶突變體及其應(yīng)用，即通過進化方法快速并高通量的定向進化蘋果酸酶，增加進化機率并應(yīng)用于琥珀酸等的生產(chǎn)。?

本發(fā)明的一個蘋果酸酶突變體，其蛋白序列為SEQ?ID?NO：1，具體就是69位氨基酸密碼子由原來的ACC變成了AGC，氨基酸由Thr變成了Ser。?