[發明專利]添加劑預混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測定方法

有效

• 申請號: 201110261982.6
• 申請日: 2011-09-06
• 公開（公告）號: CN102296117A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 周娜;劉瀅;劉鵬;王安如;彭子欣
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;漳州大北農農牧科技有限公司;哈爾濱大北農牧業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04;G01N21/64
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1.一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的快速定性測定方法，其特征在于使用釀酒酵母的DNA為模板，以釀酒酵母的26s?rDNA基因序列的種屬特異性引物進行種屬特異性PCR反應，擴增片度長度為134bp，進而快速定性釀酒酵母；所述的種屬特異性引物如下：上游引物DZf5’-CGAGAGACCGATAGCGAACA-3’，下游引物DZ?r?5’-AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3’。

2.如權1所述的快速定性測定方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A.模板DNA的制備

采用玻璃珠法制備飼料樣品模板DNA：

(1)取1g含有釀酒酵母菌的預混料樣品于1.5mL離心管中，加入500μL磷酸鹽緩沖液懸浮樣品，2500×g離心3min；

(2)棄上清，加入適量酸洗過的玻璃珠，劇烈震蕩2min；

(3)加入400μL?TE緩沖液及等體積的Tris飽和酚，翻轉混勻，15000×g離心5min；

(4)轉移水相至一新離心管，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1的混合物，顛倒混勻，15000×g離心5min；

(5)吸上清至一新離心管，加入1/10體積3mol/L醋酸鈉及2.5倍體積95％冰乙醇，-20℃過夜；

(6)4℃15000×g離心10min，棄上清；

(7)加入1mL70％乙醇，15000×g離心5min，棄上清；

(8)37℃放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60μL?TE緩沖液中，-20℃保存備用；

B.PCR擴增

反應體系25.0μL：12.5μL?2×PCR-mix、各1μL?10mmol/L上、下游引物、1μL?50ng/μL?DNA模板、二次蒸餾水補足至25.0μL；

PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃30s，60℃45s，72℃40s，進行35個循環，72℃最終延伸7min，得到的PCR產物，在溫度4℃下保存；

取5μLPCR產物，1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；

C.結果及判斷

檢測時設以目的擴增片度的膠回收產物作為模板為陽性對照，以滅菌水作為模板為陰性對照；根據在134bp處出現預期特征條帶，確定該預混料樣品中含有釀酒酵母，相反地則不含有釀酒酵母。

3.一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的快速定量測定方法，其特征在于以待測樣品cDNA和標準品的cDNA為模板，使用權利要求1中所述的上游引物和下游引物，以相同的體系同時進行釀酒酵母26s?rDNAD1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行預混料樣品中釀酒酵母的快速定量檢測。

4.如權3所述的快速定量測定方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A.樣品總RNA的制備

采用酶法破除釀酒酵母細胞壁，高純總RNA，快速提取試劑盒提取樣品總RNA：樣品0.5-1.0g加入到1.5mL離心管中，加入600μL山梨醇Buffer，加入50U溶壁酶，充分混勻30℃處理30min，1500×g離心10min后，棄上清，收集沉淀，提取樣品RNA，然后用DNase?I處理兩次，得到純化的RNA樣品，使用紫外分光光度儀測定濃度，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，然后將樣本保存于-80℃；

B.反轉錄擴增

(1)在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應混合物：

1-5μg總RNA、2μL?Oligo(dT)15、2μLdNTP、補RNase-free?ddH₂O定容至14.5μL；

(2)70℃加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，快速離心反應液后加入以下組分：4μL?5×First-Strand?Buffer(含有DTT)；0.5μL?RNasin；

(3)加入1μLTIANScript?M-MLV，輕輕用移液器混勻；

(4)42℃溫浴50min；

(5)95℃加熱5min，終止反應，置冰上進行后續實驗或冷凍保存；

(6)用RNase-free?ddH2O將反應體系稀釋到50μL。-20℃保存備用；

C.熒光定量PCR

反應體系25.0μL：12.5μL?2×SuperReal?PreMix、各0.75μL?10μmol/L上下游引物DZf和DZr，2.0μL?cDNA模板、0.5μL?50×ROX?Reference?Dye、補RNase-free?ddH2O至25μL體系；

熒光定量PCR反應參數：95℃預變性15min；95℃變性10s，60℃退火32s，40個循環；4℃保存；每個樣品重復3次；

D.外標準品的制備和標準曲線的繪制

外標準品的制備：利用分光光度計將過夜培養的釀酒酵母菌發酵液稀釋至1OD，按照上述提取總RNA步驟并通過反轉錄擴增獲得cDNA，進行10倍系列稀釋，梯度稀釋至10⁷-1個酵母cDNA/μL的濃度，以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應；

標準曲線的繪制：以不同濃度的模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數為縱坐標得到的釀酒酵母菌的標準曲線，作為待測樣品定量測定的參照標準；

E.結果及判斷

以待測樣品cDNA和標準品的cDNA為模板，用釀酒酵母菌的種特異性引物，以相同的體系同時進行釀酒酵母菌26s?rDNA?D1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行飼料樣品中釀酒酵母菌的快速定量檢測。