[發(fā)明專利]PRAME、WT1雙價腫瘤DNA疫苗

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110261931.3
• 申請日: 2011-09-06
• 公開（公告）號: CN102973950A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱義
• 申請（專利權(quán)）人: 四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及PRAME、WT1雙價腫瘤DNA疫苗。

背景技術(shù)

手術(shù)、放療和化療是癌癥治療的三種常規(guī)手段，近年來，隨著新型化療藥物的研發(fā)上市，手術(shù)與放療技術(shù)的不斷更新，腫瘤患者的長期存活率有所提高。然而，由于腫瘤的早期診斷技術(shù)還不盡完善，相當(dāng)一部分實體瘤患者在手術(shù)時已有不同程度的轉(zhuǎn)移。放療和化療雖然能在一定程度上預(yù)防擴散和轉(zhuǎn)移，但仍有相當(dāng)一部分患者不能免于復(fù)發(fā)。其次，現(xiàn)代科學(xué)證明腫瘤干細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的根源，而三大常規(guī)療法對這兩類腫瘤細(xì)胞作用很小。

腫瘤免疫學(xué)(tumor?Immunology)是利用免疫學(xué)的理論和方法，研究腫瘤的抗原性、機體的免疫功能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系，機體對腫瘤的免疫應(yīng)答及其抗腫瘤免疫的機制、腫瘤的免疫診斷和免疫防治的科學(xué)。

腫瘤免疫學(xué)在過去的十多年有突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。首先，現(xiàn)在已證明腫瘤患者存在對腫瘤的特異性免疫反應(yīng)，手術(shù)、化療、放療所治愈的部分腫瘤患者，并不是因為這些手段能殺死全部腫瘤細(xì)胞，而是由于當(dāng)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷顯著降低時，機體的免疫功能有所恢復(fù)，清除了微小殘留病灶或抑制殘留腫瘤細(xì)胞的增殖。其次，過繼免疫療法的臨床實驗證明，當(dāng)患者被注入足夠量的腫瘤特異的效應(yīng)細(xì)胞(LAK或TIL)時，不但能延長總存活期，在部分患者中并能觀察到腫塊縮小。結(jié)合這兩方面的結(jié)果，治療性腫瘤疫苗受到越來越多的關(guān)注。此類疫苗的作用機理是運用增強腫瘤特異性抗原的免疫原性的方法，誘發(fā)機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，達(dá)到縮小和消除腫瘤的目的。

目前在臨床試驗上用的腫瘤疫苗有多種形式，有細(xì)胞型(樹突狀細(xì)胞，滅活的腫瘤細(xì)胞)、細(xì)胞均漿型、合成生物大分子型(多肽、蛋白、DNA/RNA)，及病毒載體型。其中，DNA疫苗具有多方面的優(yōu)越性。第一，它能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有長期免疫記憶的免疫應(yīng)答。第二，裸露DNA不含誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)的抗原組份，而這些抗疫苗的抗體會削弱疫苗的效價。第三，生產(chǎn)與制備成本低，工藝簡單。盡管DNA疫苗的優(yōu)勢明顯，由于其在人體內(nèi)的表達(dá)效率低等原因，以致臨床效果不甚理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供PRAME、WT1雙價腫瘤DNA疫苗。該DNA疫苗構(gòu)思巧妙，在人體內(nèi)的表達(dá)率高，適用人群廣。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

PRAME、WT1雙價腫瘤DNA疫苗，該疫苗的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

所述核酸序列對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

上述PRAME、WT1雙價腫瘤DNA疫苗在制備用于腫瘤治療藥物或疫苗中的用途。

所述腫瘤為WT1陽性腫瘤和/或PRAME陽性腫瘤。

所述腫瘤包括：胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、腸癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、睪丸癌、甲狀腺癌、小細(xì)胞肺癌、間皮瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、肝癌、膽囊癌、骨癌、軟組織癌、食道癌、淋巴瘤等。

上述PRAME、WT1腫瘤DNA疫苗可以通過下述主要步驟的方法得到：

按照SEQ?ID?NO：1所示的核酸序列進(jìn)行抗原基因合成，此序列包括：多段PRAME和WT1基因片段，片段連接序列，HindIII、EcoR?I限制性內(nèi)切酶識別序列和KozaK翻譯起始序列。之后通過HindIII和EcoR?I限制性內(nèi)切酶將抗原基因和pVAX1質(zhì)粒分別進(jìn)行剪切，使其暴露粘性末端。再用DNA連接酶將抗原基因和pVAX1質(zhì)粒通過粘性末端相連，成為重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，使其在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制、擴增。經(jīng)質(zhì)粒的抽提和純化，得到滿足要求的PRAME、WT1雙價腫瘤DNA疫苗。

本發(fā)明選用多段PRAME和WT-1基因片段序列，并將這些片段以串珠方式連接，加上限制性內(nèi)切酶和Kozak翻譯起始序列進(jìn)行全基因合成，并連接到商品用載體pVAX1(Invitrogen)以完成疫苗構(gòu)建。編碼區(qū)同時連接至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，用于少量制備蛋白多肽來作為評價疫苗效價的試劑。