[發明專利]一株海洋放線菌L131及其代謝物、代謝物的制法及應用

無效

• 申請號: 201110261599.0
• 申請日: 2011-09-06
• 公開（公告）號: CN102352327A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 趙心清;王玉梅;吳毅;陳德玲;謝萌;方文晶;沈俊濤
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P1/06;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/465
• 代理公司: 大連星海專利事務所 21208
• 代理人: 于忠晶

技術領域

本發明涉及微生物領域，特別是海洋放線菌L131，另外還涉及菌株代謝物的制法和在生物農藥研究領域的應用。

背景技術

海洋環境占據地球總面積的70.8%，蘊含著豐富的微生物資源，海洋獨特的環境特點，如低溫、低營養、高壓、高鹽度等，造就了海洋微生物特有的代謝方式和代謝產物,放線菌因具有復雜的形態分化過程而具有合成種類豐富的次級代謝產物的能力。近年來，隨著分子生物學技術的發展，越來越多的海洋放線菌被發現，許多源于海洋放線菌的次級代謝產物也被鑒定出具有抗腫瘤，抗菌，抗瘧，殺蟲功能以及酶抑制劑等多種生物活性功能。海洋放線菌所產生的結構新穎、功能多樣的活性物質成為天然活性產物和新藥開發的重要來源。

番茄是全世界栽培最為普遍的果菜之一。番茄葉霉?。?i>Fulvia?fulva）是威脅保護地番茄生產的一種嚴重病害，番茄葉霉病主要危害葉片，嚴重時危害莖、花、果實等。病斑多生于葉背，出現不規則形或橢圓形淡黃色退綠斑，葉背面初生霉層，以后霉層變為灰褐色或黑褐色絨狀。果實染病后，在果蒂附近形成圓形黑色病斑，硬化稍凹陷，不能食用。因此，該病菌的感染可直接導致番茄減產，并嚴重影響番茄品質，此病一旦發生，會迅速蔓延，給番茄生產帶來巨大的損失。

針對番茄葉霉病在生產上常使用化學農藥進行防治，田間噴藥是控制番茄葉霉病流行的重要手段，通常采用粉塵或煙霧施藥和噴霧方法。粉塵施藥常用的粉塵劑有5%百菌清粉塵劑、5%加瑞農粉塵劑、7%葉面凈粉塵劑、25%斯克WP等，常用的煙劑有45%百菌清煙劑。噴霧施藥多用2%武夷霉素水劑150?倍液、50%多菌靈可濕性粉劑500?倍液、70%甲基托布津可濕性粉劑800-1000?倍液、47%加瑞農可濕性粉劑600-800?倍液等?；瘜W藥劑的防治效果明顯，防治速度快，但長期使用會使對化學藥劑的依賴性越來越大，田間一個生長季節用藥次數不斷增加，使病原菌對使用農藥抗藥性不斷增強，防治效果不斷下降，同時藥劑殘留還會造成環境的污染，影響人類的健康。因此，必須探索新的高效安全防治途徑。

近年來，生物防治研究逐漸成為熱點，生物防治的應用日益成為綜合治理植物病蟲害的重要手段，但目前獲得的高效、低毒、低殘留的抗真菌類抗生素仍然較少，因此新的抗真菌類抗生素及高效的發酵工藝，將成為保護生態環境，實現農業可持續發展的有力保證。

發明內容

本發明的目的在于提供一株海洋放線菌鏈霉菌（Streptomyces?sp.）L131，其代謝物具有顯著的抑制番茄葉霉菌的作用，公開了代謝物的制備方法，及在生物防治農藥中的應用。

本發明的一株海洋放線菌鏈霉菌株是從遼寧大連小平島海泥樣品中分離得到的鏈霉菌L131，其在Bennett培養基上生長良好，菌落凸起，表面褶皺，有白色孢子，產淡黃色可溶性色素；

所述Bennett培養基的組成為：葡萄糖10?g，蛋白胨2?g，酵母粉1?g，牛肉膏1?g，瓊脂15?g，蒸餾水1L，pH?7.2，121℃濕熱滅菌20min。

所述海洋鏈霉菌L131代謝物，通過下述制備方法制得：

（1）鏈霉菌L131的發酵

A、鏈霉菌L131種子液的制備：將平板上的菌絲和孢子接入YMG培養基中，30℃，150?rpm培養24?h得到種子液；

B、鏈霉菌L131的發酵：將鏈霉菌L131種子液以2%的接種量接入優化的發酵用培養基中，30℃，150?r/min條件下培養168?h；

所述的YMG培養基組成：葡萄糖4?g,麥芽提取物10?g,酵母提取物4?g,蒸餾水l?L,pH?5.5±0.2；優化的發酵用培養基組成：玉米粉15?g，黃豆粉15?g，酵母浸膏1.5?g，CaCO_3?0.5?g，水定容至1L，121℃濕熱滅菌20?min；

（2）鏈霉菌L131對真菌具有抑制作用的的代謝物的制備

將發酵液離心，6000?r/min離心10?min，取離心后的上清液與預處理后的大孔吸附樹脂AB-8以10:3(v:m)比例混合，置于搖床150?r/min吸附24?h，然后分別用等體積蒸餾水，40%甲醇清洗，使用等體積100%甲醇解吸，150?r/min解附24?h，解吸液使用真空旋轉蒸發儀35℃蒸干，再以少量體積甲醇將剩余物重新溶解濃縮，其為鏈霉菌L131的代謝物。

所述海洋鏈霉菌（Streptomyces）L131的代謝物在植物病害生物防治的農藥中的應用。