[發明專利]三條可用于溶藻弧菌識別檢測的寡核苷酸序列及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201110259244.8
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102329862A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 鄭江;郝聚敏;蘇永全
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.三條可用于溶藻弧菌識別檢測的寡核苷酸序列，包括SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3三條寡核苷酸序列，且采用其中一條就能完成溶藻弧菌的識別檢測；

所述SEQ?ID?No.1為：5′-GAGACCCCAG?AGGGAAGGAG?GCGGCGAAGC?GACTGGAAGG?AGACGGCGAA?GCGACTGA-3′；

所述SEQ?ID?No.2為：5′-TCAGTCGCTT?CGCCGTCTCC?TTCCAGTCGC?TTCGCCGCCT?CCTTCCCTCT?GGGGTCTCCC?TCTTGTGC-3′；

所述SEQ?ID?No.3為：5′-GCACAAGAGG?GAGACCCCAG?AGGGAAGGAG?GCGGCGAAGC?GACTGGAAGG?AGACGGCGAA?GCGACTGA-3′。

2.三條可用于溶藻弧菌識別檢測的寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫：5′-TCA?GTC?GCT?TCG?CCG?TCT?CCT?TC----N35----GCA?CAA?GAG?GGA?GAC?CCC?AGA?GGG-3′，其中N35為35個隨機寡核苷酸；

2)將寡核苷酸文庫與溶藻弧菌混合后進行SELEX篩選；

3)SELEX篩選完成后對適配子富集文庫進行克隆測序；

4)對測序結果中出現的高拷貝ssDNA進行不同長度的截取，得到一系列新的序列，再構建這些新序列的互補序列；

5)對步驟4)獲得的新序列及其互補序列進行親和特異性的驗證，獲得相應適配子。

3.如權利要求2所述的三條可用于溶藻弧菌識別檢測的寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述SELEX篩選的具體步驟如下：

2.1溶藻弧菌菌液制備

用生理鹽水將培養24h的溶藻弧菌菌落從斜面上洗滌下來，6000rpm離心5min，棄上清液，用生理鹽水重懸并稀釋菌液到下列濃度范圍：1×10⁸～9×10⁸個/ml，然后取菌液分裝20管，每管1ml的菌液，-20℃低溫保存備用；

2.2與弧菌結合

取合成好的濃度為100μM的ssDNA寡核苷酸文庫4μL，用2×結合緩沖液稀釋至100μl，95℃變性5min，冰浴10min后加入100μl自然室溫恢復的菌液，搖床結合30min，再6000rpm離心5min，棄上清，然后用1×結合緩沖液洗沉淀3次，棄上清，則沉淀部分為弧菌沉淀和與其相結合的ssDNA；

2.3分離結合的ssDNA

在步驟2.2所得的沉淀部分中加入1×結合緩沖液100μL，96℃加熱5min，使與弧菌結合的ssDNA變性，從而與弧菌分離，然后15000rpm離心10min，取上清液，再次加熱并離心，合并上清液，則可分離得到與弧菌結合的ssDNA；

2.4不對稱PCR擴增ssDNA

總體積為25μl的不對稱PCR的擴增體系為：

10×PCR緩沖液：2μl(可購于Fermentas公司)；

P1(10μM)：1μl(可購于上海生物工程公司)；

P2(0.2μM)：1μl(可購于上海生物工程公司)；

dNTP(各2.5mM)：0.4μl(可購于Takara公司)；

MgCl₂(25mM)：1.2μl(可購于Fermentas公司)；

ssDNA模板(0.2μg/μl)：2μl；

Taq?DNA聚合酶(5u/μl)：0.2μl(可購于Fermentas公司)；

ddH₂O：17.2μl；

PCR反應參數：94℃預變性4min，然后進行40個循環(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min；

2.5親和力的測定

2.5.1擴增：用帶有地高辛標記的引物P1不對稱PCR擴增篩選出來的ssDNA文庫，擴增條件和參數與步驟2.4的不對稱PCR擴增體系和參數相同；

2.5.2測定親和力：

TMB顯色系統：以四甲基聯苯胺為底物，辣根過氧化物酶標記兔抗地高辛抗體IgG的顯色系統來測定吸附到弧菌表面的適配子量；

所述測定親和力的具體步驟如下：

2.5.2.1將TMB用無水乙醇配成1mg/mL?4℃遮光保存，用前按照下列比例配制：TMB∶底物緩沖液∶30％過氧化氫＝100∶900∶1，即配即用；

2.5.2.2與菌結合：取步驟2.5.1擴增所得的PCR產物，以已知濃度梯度的初始ssDNA文庫為標準品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳法定量測定PCR產物中的DNA含量，獲得相應DNA的摩爾濃度值，然后再取該PCR產物100μL，用2×結合緩沖液100μL稀釋后，95℃變性5min后，于4℃迅速冷卻后加入到室溫恢復的100μL菌液中，充分混合，在室溫下結合30min，然后6000rpm離心，分離細菌沉淀與上清液，細菌沉淀中包含有與菌結合的帶地高辛標記的ssDNA，上清液中是未結合的ssDNA。同時做一不加ssDNA的空白；

2.5.2.3洗滌：將上述細菌沉淀用1×結合緩沖液100μL洗滌3次，6000rpm離心，棄上清，取菌沉淀；

2.5.2.4與酶標兔抗地高辛抗體結合：在菌沉淀中加入100μL雙蒸水重懸后再加入100μL?1∶900TBS稀釋過的過量的酶標兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應10min，使之與菌沉淀中的地高辛標記的ssDNA結合；

2.5.2.5洗滌：6000rpm離心，去上清，再用1×結合緩沖液100μL洗滌3次，得菌沉淀；

2.5.2.6TMB顯色：加入200μL雙蒸水重懸菌沉淀，再加入200μL?TMB顯色液，避光顯色10min后，以2mol/L?H₂SO₄?100μL終止反應，測定450nm處的吸光值OD₄₅₀，該值即反映與菌結合的ssDNA的親和力，即OD_結合，空白同樣進行上述步驟2.5.2.3，2.5.2.4，2.5.2.5和2.5.2.6，得到空白相應的吸光度OD_空白；

2.5.2.7計算相應文庫的親和力：

2.6重復篩選

以每一輪不對稱PCR的產物作為下一輪的篩選文庫，重復上述SELEX篩選步驟2.1～2.5，直到親和力不再明顯上升為止，最終篩選得到適配子的富集文庫。