[發明專利]一種對重金屬銅高度敏感的生物傳感器的制備方法及其產品

有效

• 申請號: 201110259158.7
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102417901A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 譚國強;李東;王娟娟;趙建國;洪旭芬
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12N15/62;C12N1/21
• 代理公司: 溫州甌越專利代理有限公司 33211
• 代理人: 傅敏華

1.一種對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于：包含以下步驟：

(1)利用條件復制質粒pKD46和pCP20，利用Red重組系統，敲除野生型大腸桿菌E.coli?MC4100基因組中copA、cueO和cusA三個基因，構建ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突變菌株；

(2)利用交叉PCR技術構建含有報告基因gfpmut2與大腸桿菌copA基因啟動子PcopA及轉錄終止子SoxS相融合的融合報告基因PcopA::gfpmut2；

(3)將步驟2所得片段克隆到pMD18-T載體上，構建PcopA::gfpmut2-T重組載體；

(4)測序分析正確的重組載體PcopA::gfpmut2-T經雙酶切切下目的條帶連接到pET28a載體上，構建融合報告載體PcopA::gfpmut2-pET28a；

(5)將步驟(4)所得融合報告載體轉入步驟1構建的ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突變菌株。

2.根據權利要求1所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于：步驟(1)中ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突變菌株的制備依次包括有如下步驟：1、引物信息及合成；2、單突變菌ΔcopA的制備；3、雙突變菌ΔcopA-ΔcueO的制備；4、三突變菌ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA的制備；其中上述步驟2中的單突變菌ΔcopA的制備具體是：一、pKD46/MC4100菌株制備；二、帶FRT位點的cat基因PCR擴增；三、pKD46/MC4100電轉感受態細胞的制備；四、電轉化cat基因；五、cat基因的PCR鑒定；六、pCP20的轉化；七、cat抗性基因的消除；八、ΔcopA單突變菌的純化。

3.根據權利要求1或2所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于：所述的報告基因選用選用編碼增強型綠色熒光蛋白的gfpmut2基因，融合報告基因PcopA::gfpmut2的制備依次包括有如下步驟：1、引物信息及合成；2、E.coli?MC4100細菌基因組DNA的提取；3、PCR擴增PcopA；4、PCR擴增gfpmut2-soxSCo基因；5、交叉PCR獲得融合報告基因PcopA::gfpmut2；6、PCR產物膠回收。

4.根據權利要求1或2所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于：融合報告載體PcopA::gfpmut2-pET28a制備依次包括有如下步驟：(一)試劑盒提取質粒pET28a；(二)pET28a質粒的雙酶切及其回收；(三)目的片斷與載體的連接反應；(四)將連接好的重組質粒轉入DH5α感受態細胞中；(五)陽性克隆的鑒定。

5.根據權利要求3所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于：融合報告載體PcopA::gfpmut2-pET28a制備依次包括有如下步驟：(一)試劑盒提取質粒pET28a；(二)pET28a質粒的雙酶切及其回收；(三)目的片斷與載體的連接反應；(四)將連接好的重組質粒轉入DH5α感受態細胞中；(五)陽性克隆的鑒定。

6.按照上述制備方法得到的對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器，其特征在于：由野生型大腸桿菌E.coli?MC4100缺失copA、cueO和cusA三個基因，并轉入融合報告載體PcopA::gfpmut2-pET28a。