[發明專利]睪酮(T)定量測定試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201110257888.3
• 申請日: 2011-08-31
• 公開（公告）號: CN102331503A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 內蒙古科慧生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/558;G01N21/76
• 代理公司: 北京富天民宏濟知識產權代理事務所(普通合伙) 11272
• 代理人: 劉壽椿;龔雅民

1.一種睪酮T的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含T磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，T校準品、T質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的T磁分離試劑含有標記有抗T單克隆抗體的磁性微球；

所述的酶反應物是含有堿性磷酸酶標記的T抗原；

所述的反應增強劑是含有Tris的緩沖液；

所述稀釋液是含有BSA的溶液；

所述的校準品及質控品是含有一定量的T抗原的BSA溶液；

所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液；

所述的底物溶液為酶促化學發光底物溶液。

3.如權利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得：

一、磁分離試劑的制備過程

一)、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制1L：

(1)、稱取TRIS?4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，稱取0.96g?TWEEN-20于20ml容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

(2)、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml純化水，充分攪拌；

(3)、調節PH，控制PH在7.95-8.05之間；

(4)、稱取BSA?3g倒入上述1L容器中；

(5)、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；

二)、磁分離試劑的制備過程

(1)、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul?DMSO中，取2mg抗T單克隆抗體溶于PH?9.5的0.1mol/L?PB緩沖液中至總體積為1ml；

(2)、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min；

(3)、將步驟2抗體溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機中在3000g下離心30min濃縮至0.5ml；

(4)、取0.5ml磁珠，加入5ml反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清，然后加入1.5ml?PH9.50.1mol/L?PB，混勻30秒，然后加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應4小時；

(5)、加入0.3ml?lmol/L的TRIS溶液37℃15分鐘，然后加入1.5ml?PH?7.20.1mol/L?PB清?洗已經標記的磁珠，混勻30秒；

(6)、用100ml磁珠保存液將磁珠轉入玻璃瓶；

(7)、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩沖液按照1∶1的體積比例混勻，即得權利要求1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；

二、酶反應物的制備過程

一)、酶反應物稀釋液配制操作步驟，配制1L：

(1)、取Tris?6.06g、NaCl?13.0g、Zncl₂?0.05g、Proclin-300?0.2ml和MgCl₂?0.05g于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；

(2)、調PH，控制PH在7.35-7.45范圍內；

(3)、稱取BSA?3g倒入上述燒杯中；

(4)、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；

二)、堿性磷酸酶ALP與T抗原的偶聯

(1)、取T-3-cmo-BSA抗原；

(2)、取200ul?DMSO溶解抗原使抗原的終濃度到達5mg/ml，充分混勻；

(3)、按照1mol抗原加入10mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到步驟2的溶液中，37℃恒溫箱中反應1.5小時；

(4)、按照3mol抗原加入1mol的ALP的摩爾比往步驟3溶液中添加ALP，然后加入1mlPH為7.4濃度為0.1M的PB緩沖液，置于37度恒溫箱中反應3小時；

(5)、將步驟4的溶液用PD-10柱純化，收集純化液，按照1∶3000的體積比添加上述步驟一)獲得的酶反應物稀釋液，混合均勻，即得酶反應物。

三、反應增強劑的制備過程，配制1L：

(1)、取TRIS1.56g和NaCl?4.23g于1L容器中，取0.2ml?Proclin-300于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

(2)、取800ml純化水于上述1L容器中，充分攪拌直至完全溶解，調PH在7.35-7.45之間；

(3)、稱取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；

四、稀釋液的制備過程，配制1L：

(1)、稱取NaC19.0g和BSA?60g于1L的容器中；

(2)、取0.5ml?Proclin-300加10ml純化水溶解，倒入上述1L的容器中；

(3)、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；

五、T校準品和T質控品的配制：?

T校準品中T抗原的濃度分別為0.5，1，4，8，17ng/ml；T質控品中T抗原的濃度分別為1，8ng/ml；

六、清洗液濃縮液的制備過程，配制1L：

(1)、取TRIS?12.54g和NaCl?325.6g于1L容器中；

(2)、取5g?Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

(3)、取0.2ml?Proclin-300于盛有10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

(4)、取800ml純化水于上述1L容器中，充分攪拌，直至完全溶解；

(5)、調PH，控制其范圍在7.35-7.45之間；

(6)、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得；

七、底物溶液的制備過程，配制1L：

(1)、取TRIS?2.35g、NaCl?6.41g、Na₂SO₃?0.002g和Proclin-300?0.2ml于1L燒杯中；

(2)_、取600ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH在7.95-8.05之間；

(3)、加入250ml?Lumi-Phos?480，用0.2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。