[發明專利]一種煙曲霉發酵生產阿魏酸酯酶的方法

無效

• 申請號: 201110257798.4
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102286442A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 陳啟和;方若思;何國慶;傅明亮;董亞晨;馮宇
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12R1/68
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于生物工程和微生物發酵領域，尤其涉及一種煙曲霉發酵生產阿魏酸酯酶的方法。

背景技術

阿魏酸(Ferulic?acid，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)大量存在于植物和食品原料中，研究發現，阿魏酸在抗氧化性、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突變和防癌等方面均表現出較強的活性。植物細胞壁木質素中，阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸類物質以酯鍵方式與半纖維素支鏈形成致密網狀交聯結構，從空間上限制了動物或微生物對植物細胞壁的有效降解。除了纖維素酶、β-糖苷酶參與降解纖維素和半纖維素分子外，越來越多研究表明，阿魏酸酯酶、木聚糖酶等可以協同降解致密網狀交聯結構。

阿魏酸酯酶(Ferulic?acid?esterase)又稱肉桂酸酯酶，它是一種羧酸酯酶，屬胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵。用阿魏酸酯酶處理植物性原料，能將有藥用價值和保健功能的阿魏酸游離出來，同時，植物性原料通過阿魏酸酯酶的處理細胞壁會變得疏松，后續作為飼料工業的原料更容易被禽畜消化利用。為此，研究高酶活阿魏酸酯酶的獲得和制備方法具有重要意義。

研究表明，真菌、細菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、乳酸菌、熱纖梭菌等。各種微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽鏈的結構、物化性質和催化特性上都有所不同，其中，由黑曲霉(Aspergillus?niger)得到的兩種阿魏酸酯酶FAEA和FAEB受到研究者普遍關注。

公開號為CN101200712A的發明專利申請公開了一種固態發酵生產阿魏酸酯酶的方法，以汽爆處理植物秸稈和麩皮為發酵培養基主要原料，以篩選獲得的黑曲霉為菌種，通過固態發酵生產方式生產阿魏酸酯酶。目前，工業上對阿魏酸酯酶的需求很大，應用于工業的阿魏酸酯酶也主要由黑曲霉生產，由于黑曲霉的阿魏酸酯酶對高溫、酸或堿等條件耐受性不足，一定程度上限制了阿魏酸酯酶在工業上的應用。因此，篩選高產阿魏酸酯酶的微生物菌株并研究相關的發酵培養體系，有利于阿魏酸酯酶更廣泛的工業化應用。

發明內容

本發明提供了一種煙曲霉發酵生產阿魏酸酯酶的方法，以玉米粉或麩皮為發酵原料，利用煙曲霉通過微生物發酵法生產阿魏酸酯酶，工藝簡單，條件溫和，阿魏酸酯酶活性高。

將經活化的煙曲霉(Aspergillus?fumigatus)CGMCC?No.3.5835接種于培養液中，并在25～30℃下發酵培養2～6天；

其中，所述的培養液由玉米粉或麩皮與基礎液體培養基組成。

發酵液經離心操作，取上清液，即得到含阿魏酸酯酶的酶液。

所述的煙曲霉CGMCC?No.3.5835購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌株編號為CGMCC?No.3.5835。該煙曲霉經過鑒定屬于半知菌綱(Fungi?Imperficti)，殼霉目(Sphaeropsidales)，杯霉科(Discellaceae)，曲霉屬(Aspergillus)。在馬鈴薯(PDA)固體培養基上，菌株生長較滿，形成淡綠色或綠色孢子。

接種時，可以先制備濃度為1×10⁶～1×10⁸個/mL的煙曲霉CGMCC?No.3.5835孢子懸浮液，將該孢子懸浮液接種到培養液中，接種量優選為30～150mL/1L培養液。

所述的玉米粉或麩皮的粒徑優選為40～60目。

優選的，以體積1L計，所述的基礎液體培養基包括：KH₂PO₄?1～4g，Na₂HPO₄·7H₂O?1～6g，NaCl?0～0.2g，酵母粉5～10g，MgSO₄·7H₂O?0.1～0.3g，CaCl₂?0～0.05g。

所述的培養液中玉米粉或麩皮的質量百分比濃度為1～3％。

在所述的發酵培養條件下，玉米粉能更好地誘導煙曲霉表達和分泌阿魏酸酯酶。

所述發酵培養的溫度優選為28℃，時間優選為4～5天。在該發酵培養條件下，煙曲霉發酵玉米粉或麩皮產阿魏酸酯酶活性最高。

所述的培養液可以置于搖床中進行發酵培養，搖床轉速優選為120～150rpm，更優選為140rpm，這樣更有利于微生物細胞的分散及其與發酵原料之間的充分接觸。