[發明專利]用于間充質干細胞培養的試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201110257416.8
• 申請日: 2011-09-01
• 公開（公告）號: CN102965335A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 田杰
• 申請（專利權）人: 北京清美聯創干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種用于間充質干細胞培養的試劑盒及其應用。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。間充質干細胞包括臍帶間充質干細胞和骨髓間充質干細胞。

臍帶間充質干細胞是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細胞，具有來源廣泛、易于采集、保存和運輸、無異體排斥、避免倫理爭議等諸多優點。流式細胞儀分析發現臍帶間充質干細胞高表達間質細胞標志(CD44、CD105)、整合素受體(CD29、CD49b、CD49c、CD51)、不表達造血系標志(CD34、CD45)白細胞抗原HLA-DR和內皮細胞標志CD31。臍帶間充質干細胞在體內外可以分化為骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞以及神經元細胞等。目前人臍帶間充質干細胞在組織工程骨、人工血管以及基因治療等臨床應用研究中已逐漸深入，并已顯示出廣闊的應用前景。??目前，對臍帶間充質干細胞的分離培養、擴增還沒有統一的標準，存在純度低、原代培養時間長等缺點。各種類型的成纖維成體干細胞擴增一般在2～3天開始進入指數式生長，相差不大，而原代細胞由于組織來源不同，出現細胞克隆時間差異較大，所以，原代細胞傳代時間是分離得到目的細胞的關鍵。

發明內容

本發明提供了一種用于間充質干細胞培養的試劑盒及其應用。

本發明的用于間充質干細胞培養的試劑盒包括細胞培養液A和細胞培養液B；所述細胞培養液A為含80-120ng/ml細胞因子LIF(優選為100ng/ml)與80-120ng/ml細胞因子bFGF(優選為100ng/ml)的Knockout-DMEM培養基(液體)；所述細胞培養液B為胎牛血清。

所述所述細胞培養液A和所述細胞培養液B均為無菌的。

所述細胞培養液A和所述細胞培養液B均獨立包裝。

本發明的試劑盒還可包括細胞洗滌液和細胞消化液；所述細胞洗滌液為生理鹽水；所述細胞消化液為Collagenase?II(膠原酶II)水溶液。

所述細胞消化液具體可為0.2g/100ml?Collagenase?II水溶液。

所述生理鹽水由氯化鈉和水組成，氯化鈉的濃度具體可為0.9g/100ml。

所述細胞洗滌液、所述細胞培養液A、所述細胞培養液B和所述細胞消化液均為無菌的。

所述試劑盒中，所述細胞洗滌液、所述細胞培養液A、所述細胞培養液B和所述細胞消化液均獨立包裝。

所述間充質干細胞具體可為臍帶間充質干細胞。所述臍帶間充質干細胞優選為離體的臍帶間充質干細胞。所述間充質干細胞具體可為獲自離體的哺乳動物組織的間充質干細胞，如獲自離體的人臍帶組織的臍帶間充質干細胞。

所述試劑盒可用于間充質干細胞培養。

應用所述試劑盒時，所述細胞培養液A和所述細胞培養液B優選按照5∶1的體積比混合。

所述間充質干細胞具體可為臍帶間充質干細胞。所述臍帶間充質干細胞優選為離體的臍帶間充質干細胞。所述間充質干細胞具體可為獲自離體的哺乳動物組織的間充質干細胞，如獲自離體的人臍帶組織的臍帶間充質干細胞。

本發明的試劑盒的應用原理為：采用Collagenase?II酶有效處理臍帶蛋白膠質，利用細胞因子(LIF、bFGF)組合對臍帶間充質干細胞的促進作用，從而確保了原代細胞分離數量和減少原代培養時間。本發明提供的試劑盒能從離體臍帶中分離臍帶間充質干細胞，并培養所述臍帶間充質干細胞，具有細胞擴增速度快、擴增效率高的優點，且多次傳代后依然保持有細胞全能性。本發明解決了臍帶間充質干細胞分離的純度、數量和原代培養時間問題，可以獲得大量臍帶間充質干細胞，為利用臍帶間充質干細胞進行進一步實驗研究提供了豐富的來源。

附圖說明

圖1為原代細胞培養7天后的細胞照片。

圖2為傳代20次后細胞的表面抗原CD29表達情況。

圖3為傳代20次后細胞的表面抗原CD34表達情況。