[發(fā)明專利]副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法與用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110256786.X
• 申請日: 2011-09-01
• 公開（公告）號: CN102274494A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王洪斌;成明;李信書;李士虎
• 申請（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;C12N15/31;C12N15/70;C07K14/28;A61P31/04
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法，其特征在于：其步驟如下：

（1）擴(kuò)增目的基因tdh：

引物1：5’-GCGAATTC?ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3’，

引物2：5’-GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC-3’，

????在引物1、2的5’端分別引入EcoRI、HindIII酶切位點(diǎn)；以副溶血性弧菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增副溶血性弧菌溶血毒素基因tdh；反應(yīng)體系為50?μl，引物各200?nmol／L，dNTP各50?μmol／L，模板50?ng，95?℃預(yù)變性5?min，然后按94?℃?30秒、53?℃?40秒、72?℃?50秒循環(huán)35?次，72℃終止延伸10分鐘，產(chǎn)物割膠回收，得到目的基因片段tdh；

（2）克隆表達(dá)：將目的基因片段tdh克隆至載體pET-28，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28-TDH，pET-28-TDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21；接種于LB培養(yǎng)液中，37℃、180r/min過夜，次日將該菌液以2％比例接種于5ml?LB培養(yǎng)基中，37℃、180r/min培養(yǎng)2小時后，取1ml菌液，OD600為0.5-0.7測吸光度，并收集菌體作為誘導(dǎo)表達(dá)前的對照菌體，其余菌液中加0.1mol／L的IPTG至終濃度為1mmol／L，20℃、200r/min誘導(dǎo)10小時后，5000r/min、5min收集菌體；用100μl重蒸水懸浮菌體，加等體積2×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10分鐘，進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析；以沒有克隆tdh的pET-28空質(zhì)粒及未經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒作為陰性對照；誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集沉淀，超聲波破壁，按非變性條件抽提純化蛋白過程進(jìn)行純化，聚乙二醇8000濃縮后，測其OD260、OD280，計(jì)算蛋白含量；得克隆表達(dá)產(chǎn)物；

（3）斑點(diǎn)印跡反應(yīng)檢測：取10μl?克隆表達(dá)產(chǎn)物滴加在醋酸纖維膜上，50℃烘干10?分鐘，后用5％脫脂牛奶封閉1小時；TBS緩沖液洗3次后，晾干；用封閉液稀釋第一抗體His-tag，稀釋倍數(shù)為1：5000，37℃下脫色搖床上緩慢搖動1小時；用TBS洗膜三次，每次5?分鐘；封閉液稀釋第二抗體堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體IgG，稀釋比例為1：20000，37?℃下脫色搖床上緩慢搖動1?小時；TBS洗膜一次；AP底物緩沖液洗膜二次；在10?mL?AP底物緩沖液中加入BCIP?33?μl、NBT?66μl，顯色至斑點(diǎn)清楚，確認(rèn)克隆表達(dá)產(chǎn)物為TDH蛋白；該TDH蛋白即為副溶血性弧菌毒素；將TDH蛋白經(jīng)0.3%甲醛脫毒處理，得到副溶血性弧菌類毒素；

（4）疫苗制備：將副溶血性弧菌類毒素與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，即得副溶血性弧菌類毒素疫苗。

2.一種用權(quán)利要求1所述的方法制得的副溶血性弧菌類毒素疫苗用于受到副溶血性弧菌攻擊的海洋魚類的免疫藥物的用途。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述的海洋魚類為真鯛、墨魚、海魚、海蝦、海蟹或者海蜇。