[發明專利]培養嗜鹽微生物生產四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法

無效

• 申請號: 201110256094.5
• 申請日: 2011-09-01
• 公開（公告）號: CN102286564A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 朱道辰;吳建;陳華友;王成棟;陳焱
• 申請（專利權）人: 朱道辰
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的生產方法，尤其是一種培養嗜鹽微生物生產四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法。

背景技術

四氫嘧啶是一種嗜鹽微生物為了抵御外界高鹽濃度的體內合成的一種相容性溶質，并且一些嗜鹽微生物能夠合成四氫嘧啶的衍生物-羥基四氫嘧啶。四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶與其他已知的相容性溶質相比，其對細胞、核酸、酶、蛋白等在射線、干燥、冷凍、高溫、高鹽等極端條件下具有更好的保護作用。

由于其特殊的結構，截至目前還不能夠人工合成四氫嘧啶或者羥基四氫嘧啶，只能通過微生物胞內合成獲得。目前據公開文獻報道，四氫嘧啶的合成主要是采用細菌擠奶法進行生產，以及進行高密度發酵。

普通發酵方法是：對于四氫嘧啶的生產，種子培養同上述1，2步驟，然后150ml種子菌液接種到3L發酵培養基，30℃培養，pH控制在7.0-7.2，。發酵培養基中氯化鈉濃度為3M，其它同上。培養42h離心收集菌體，酒精提取四氫嘧啶，濃縮，膜過濾，結晶得到產物。對于羥基四氫嘧啶的生產，種子培養同上述1，2步驟，然后150ml種子菌液接種到3L發酵培養基，30℃培養20h后42℃培養，pH控制在7.0-7.2。發酵培養基中氯化鈉濃度控制在3M，繼續培養31h后離心收集菌體，酒精提取四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶，濃縮，膜過濾，結晶得到產物。

由于嗜鹽菌的最適生長的鹽濃度和能夠達到高產四氫嘧啶的鹽濃度不一致，影響了四氫嘧啶的合成效率，例如中度嗜鹽菌Halomonas?ventosae?DL7，其最適生長鹽濃度為1M，但是最優合成四氫嘧啶的鹽濃度為3M。羥基四氫嘧啶作為四氫嘧啶的衍生物其合成受到熱刺激的誘導，在嗜鹽菌的最優生長溫度下只有少量合成，通常要提高生長溫度才能夠較多量的合成，例如Halomonas?ventosae?DL7在營養培養基試管中搖床培養，培養溫度從30℃提高到37℃或者42℃，但是提高生長溫度嚴重抑制了其生長，又導致了四氫嘧啶合成量的嚴重下降，也從而影響了羥基四氫嘧啶的產量。

發明內容

本發明的目的是提供一種以合理成本提高四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的合成效率的培養嗜鹽微生物生產四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法。

實現本發明目的之一的培養嗜鹽微生物生產四氫嘧啶的方法，包括如下步驟：

(1)菌種活化，將嗜鹽菌種放入盛有營養液的試管中，在搖床上進行培養活化；

(2)種子培養，將活化后的菌種放入盛有培養液和嗜鹽菌種的三角瓶中，在搖床上進行培養；

(3)發酵階段，發酵在嗜鹽菌的最優生長鹽分下培養，將細胞增殖到最高濃度；

(4)通過補料將培養基的鹽濃度迅速提高到3～3.5M，然后繼續培養3～8h，使四氫嘧啶的合成量大大提高。

所述步驟(1)中的菌種活化是在溫度30℃，搖床培養18～24h。

所述步驟(2)中的種子培養是在溫度30℃，搖床培養18～24h。

所述步驟(3)中的最優生長鹽分是1～2M?NaCl，培養18～24h，達到最高濃度。

所述步驟(4)中的補料提高鹽濃度的時間為1～2h。

實現本發明目的之二的培養嗜鹽微生物生產羥基四氫嘧啶的方法，包括如下步驟：

(1)菌種活化，將嗜鹽菌種放入盛有營養液的試管中，在搖床上進行培養活化；

(2)種子培養，將活化后的菌種放入盛有培養液和嗜鹽菌種的三角瓶中，在搖床上進行培養；

(3)發酵階段，發酵在嗜鹽菌的最優生長鹽分下培養，將細胞增殖到最高濃度；

(4)通過補料將培養基的鹽濃度迅速提高到3～3.5M，然后繼續培養3-8h，使四氫嘧啶的合成量大大提高；

(5)將培養溫度從最優生長溫度提高到較高溫度，繼續培養3～10h，獲得較高的羥基四氫嘧啶合成量。

所述步驟(1)中的菌種活化是在溫度30℃，搖床培養18～24h；所述步驟(2)中的種子培養是在溫度30℃，搖床培養18～24h。

所述步驟(3)中的最優生長鹽分是1～2M?NaCl，培養18～24h，達到最高濃度。

所述步驟(4)中的補料提高鹽濃度的時間為1～2h。

所述步驟(5)中的最優生長溫度是30～32℃；提高溫度的時間是1～2h；所述較高溫度是37～42℃。

本發明的培養嗜鹽微生物生產四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法的有益效果如下：