[發明專利]黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒及其制法

無效

• 申請號: 201110253830.1
• 申請日: 2011-08-31
• 公開（公告）號: CN102401832A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 宋慧君;馬惠蕊;蔣丹;劉淑艷
• 申請（專利權）人: 宋慧君;馬惠蕊;蔣丹;劉淑艷
• 主分類號: G01N33/64
• 分類號: G01N33/64;G01N33/543;G01N33/532
• 代理公司: 大連星海專利事務所 21208
• 代理人: 于忠晶

1.一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是：試劑盒內分別裝有緩沖液、黃曲霉毒素B1-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶聯微球、生物素標記AFB1多克隆抗體和/或ZEN單克隆抗體、不同濃度倍比稀釋AFB1標準品和/或不同濃度倍比稀釋ZEN?標準品。

2.根據權利要求1所述的一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是：所述緩沖液選用：0.1M?PBS，pH?7.4或50?mM?HEPES，pH?7.4或20?mM?MOPS，?pH?7.2或50?mM?MES，pH?6.5。

3.根據權利要求1所述的一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是：所述微球選用：Luminex?1-100號羧基化微球。

4.根據權利要求1－3任一所述的一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片檢測試劑盒，其特征是：緩沖液中懸浮有分別偶聯黃曲霉毒素B1-BSA和玉米赤霉烯酮-BSA的微球，黃曲霉毒素B1-BSA多抗臨界飽和濃度為0-6.0ng/μL；玉米赤霉烯酮-BSA單抗臨界飽和濃度為0-2.0μg/mL。

5.一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片二重檢測試劑盒的制法：

第一步微球偶聯：偶聯操作參照Luminex?偶聯操作說明書進行，取28號微球和36號微球各100μL，分別偶聯AFB1-BSA和ZEN-BSA各100μg；

偶聯質控：?取28號和36號微球各10μL，分別偶聯生物素標記兔抗羊IgG各10μg；

A：計算微球得率：取上述懸浮微球，4μL?/管，用微球保存液稀釋至125μL，采用血球計數板在光學顯微鏡下進行微球計數；每個離心管取3份樣品進行計數，并取其平均值，用該平均值根據計算公式（1）和（2）計算偶聯微球得率，偶聯微球得率符合Luminex操作要求；

偶聯微球數量（個）=（平均值/4）×10⁴×（125/4）×0.1…?公式（1）

偶聯微球得率=[偶聯微球數量/（6.25×10⁵）]×100%……..??公式（2）

B：檢測偶聯微球質量：包括空白質控、陰性質控、偶聯質控檢測，

空白質控：取原始28號和36號微球各10μL，分別加入到1.5?mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μL，分別加入微球封閉液，?25μL/管，混勻，37℃避光孵育30min；?

陰性質控：取偶聯AFB1-BSA的28號微球以及ZEN-BSA偶聯36號微球各10μL，分別加入到1.5?mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μL，分別加入4μg/mL?SAPE，25μL/管，混勻，37℃避光孵育30min；?

偶聯質控：取偶聯生物素標記兔抗羊IgG的28號和36號微球各10μL，

分別加入到1.5?mL離心管中，并用偶聯緩沖液稀釋至100μL，分別加入4μg/mL?SAPE，25μL/管，混勻，37℃避光孵育30min；分別取75μl上述30min孵育產物，加入液相芯片系統中進行測試；

判斷標準：液相芯片偶聯實驗結果應同時滿足以下三個條件：1）空白質控MFI低于50；2）陰性質控MFI低于100；3）偶聯質控MFI要求高于1000，并遠大于Cutoff值，偶聯微球質量符合質量判斷標準，備用；

第二步標記抗體生物素：

嚴格按照Pierce生物素標記試劑盒(EZ-Link?Sulfo-NHS-Biotinylation?Kit)操作說明書進行，質量控制要求，

A500H/A≈0.9-1.3；

A500H/A/B≈2.0-3.0；

抗體生物素標記符合EZ-Link?Sulfo-NHS-Biotinylation?Kit質量標準，備用；

第三步確定抗體臨界飽和濃度：

在1.5mL的離心管中按表3依次加入36#100偶聯微球、28#100偶聯微球、生物素標記ZEN單克隆抗體、生物素標記AFB1多克隆抗體，最后用PBS補足體積至100μL；每個反應體系重復配制3個；混勻，避光37℃孵育24h；配制4μg/mL?SA-PE；向每個離心管里加25μL?4μg/mL?SA-PE；混勻，37℃避光孵育30min；取上述反應液，75μl/反應體系，加入液相芯片中測試；用EXCEL軟件對實驗結果求平均值，并將抗體濃度和其對應的熒光信號值繪制散點圖，根據散點圖呈現趨勢，選取線性關系較好的點進行直線擬合，求其R²，最R²對應的抗體濃度即為臨界飽和濃度。