[發明專利]結核與非結核分枝桿菌快速檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201110253447.6
• 申請日: 2011-08-30
• 公開（公告）號: CN102277440A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 吳蓓蓓;王曉萌;叢黎明;帥江冰
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種結核與非結核分枝桿菌快速檢測試劑盒及檢測方法。

(二)背景技術

結核病是嚴重危害我國人民健康的慢性傳染病，它不僅是重要的公共衛生問題，而且是一個復雜的社會經濟問題，在一定程度上影響了社會經濟的發展。其疫情的嚴重性主要表現為高感染率、高患病率、高死亡率、高耐藥率、低遞降率。盡管近年來我國在執行標準化治療和提高治愈率上有了長足的進步，但仍然是結核病高負擔國家。快速準確診斷技術的缺乏和病人發現的困難是我國控制結核病的最大障礙。我國依舊用落后的細菌學方法(痰涂片及固體培養)作為結核病的實驗室診斷工具，檢出率低、漏檢率高、時效性差，嚴重延誤患者特別是耐多藥結核病患者的最佳治療時間。非結核分枝桿菌廣泛存在于自然界，當機體免疫受損時，也會引發肺內或肺外感染，其臨床癥狀與結核病酷似，臨床上固體培養陽性的分枝桿菌中，5％-10％為非結核分枝桿菌。目前國內外已建立了一些檢測結核分枝桿菌的分子生物學方法，但非結核分枝桿菌的檢測方法較少，同時檢測結核與非結核分枝桿菌并能穩定應用于臨床樣本的檢測方法更少。

(三)發明內容

本發明要解決的技術問題是：克服現有技術中的不足，提供一種快速檢測試劑盒，以及基于該試劑盒的檢測方法。

本發明通過對16S?rRNA及新基因Rv0355的分析、引物的選擇以及檢測條件的優化，設計一種準確、靈敏、快速的雙重PCR檢測試劑盒及檢測方法，以期提高我國結核與非結核分枝桿菌檢測能力。

本發明采用的技術方案是：

一種結核與非結核分枝桿菌快速檢測試劑盒，主要包括樣品DNA提取試劑、PCR反應試劑和特異性擴增引物，其特征在于：所述特異性擴增引物由16S?rRNA擴增引物MTC與Rv0355擴增引物CD192組成，所述引物序列如下：

引物MTC(產物長度543bp)：

上游引物MTC-1：5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’

下游引物MTC-2：5’-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’

引物CD192(產物長度238bp)：

上游引物CD192-1：5’-TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3’

下游引物CD192-2：5’-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3’。

本發明的關鍵在于擴增引物的設計，試劑盒中其他組成，可按本領域常規進行選擇。其中樣品DNA提取試劑可包括稀釋液和裂解液，PCR反應試劑包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其中PCR緩沖液可采用市購商品，也可自行配制，例如將Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合進行配制，進行檢測時，將PCR反應試劑和擴增引物混合，再加入待測樣品或對照品，即可進行PCR擴增反應。

為進一步提高試劑盒檢測準確性，所述試劑盒中還可包括結核分枝桿菌陽性對照品和非結核分枝桿菌陽性對照品。

具體的，所述試劑盒可由5個凍存管組成：

凍存管A裝有裂解液5mL；

凍存管B裝有PCR反應體系溶液，組成如下：

溶劑為水；

PCR?buffer終濃度為1×，是指PCR?buffer中各組分在PCR反應體系中的終濃度與1×PCR?buffer相同。通常采用體積為PCR反應體系1/10的10×PCR?buffer，或者1/5的5×PCR?buffer。

凍存管C裝有0.2mL結核分枝桿菌陽性對照溶液；

凍存管D裝有0.2mL非結核分枝桿菌陽性對照溶液；

凍存管E裝有稀釋液5mL。

本發明還涉及一種利用所述試劑盒檢測結核與非結核分枝桿菌的方法，所述方法包括：

(1)利用DNA提取試劑提取待測樣品DNA；

(2)以待測樣品DNA為模板，加入PCR反應試劑和特異性擴增引物配制PCR反應體系，進行PCR擴增；

(3)擴增產物進行凝膠成像系統分析，若待測樣品擴增出543bp和238bp兩條條帶，判斷為結核分枝桿菌；若待測樣品只擴增出543bp條帶，則判斷為非結核分枝桿菌。

優選的，所述試劑盒由5個凍存管組成：

凍存管A裝有裂解液5mL；

凍存管B裝有PCR反應體系溶液，組成如下：

溶劑為水；

凍存管C裝有0.2mL結核分枝桿菌陽性對照溶液；