[發明專利]一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應用

有效

• 申請號: 201110252908.8
• 申請日: 2011-08-30
• 公開（公告）號: CN102304478A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 陳堅;李江華;李華祥;堵國成;劉龍;楊海泉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/04;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應用，可用于白僵菌孢子制劑制備、保藏和田間應用等領域。

背景技術

隨著人類對環境保護和自身健康的日益關注，大力推廣生物農藥已成為全球農藥產業發展的新趨勢。白僵菌作為一種廣譜性病原真菌，因其具有易于生產、寄主范圍廣、侵染期長、不傷害人和其他脊椎動物及可貴的流行潛力等優點而成為目前世界上研究和應用最多的為微生物農藥之一。

本發明中所用的菌株(球孢白僵菌CCTCC?No：M209238)對目前茶樹頭號害蟲——“假眼單胞小綠葉蟬”有顯著防治效果。然而，白僵菌孢子制劑在制備、保藏和使用過程中，都會因受到熱損傷而導致孢子活性降低甚至死亡。其中，制備過程中的熱來自干燥，保藏過程中的熱來自保藏環境，使用(田間應用)過程中的熱來自陽光照射或寄主的行為發熱。因此，提高白僵菌孢子的抗熱性，對提高其殺蟲率和生物防治效果至關重要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法。

為解決上述技術問題，提供如下技術方案：

將0.1-0.65g/mL甘露醇添加于球孢白僵菌的孢子懸浮液。

所述球孢白僵菌(Beauveria?bassiana)保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?No：M209238，該菌株信息已在中國專利200910264664.8中公開，公布日2010年6月9日，公布號CN101724571A。

優選添加甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物于球孢白僵菌的孢子懸液，其中0.15-0.35g/mL甘露醇、0.15-0.35g/mL葡萄糖和0.15-0.35g/mL乳糖。

甘露醇及含甘露醇的混合物添加方法為：取適量的甘露醇或甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物于25mL試管中，加入9.5mL?0.05％的吐溫-80溶液，沸水浴并攪拌至糖類完全溶解，冰水浴冷卻后，加入0.5mL?2×10⁹孢子/mL的孢子懸浮液，并用振蕩器將其混勻。

孢子抗熱性的檢測方法：1)將添加了甘露醇或甘露醇混合物的孢子懸浮液均勻混合液置于45℃恒溫水浴鍋中，水浴10min(同時震蕩)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷卻；2)將冷卻后的混合液轉移到250mL三角瓶中，再加入40mL?2.5％麩皮浸出液，混勻，置于25℃，180r/min搖床中培養12h；3)用膠頭吸管吸取一滴培養液，滴到血球計數板上，并于電子顯微鏡下檢測并計算其孢子萌發率(當芽管長度不小于孢子直徑時，該孢子視為已萌發)。

本發明還提供了一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性方法的應用，是將甘露醇或甘露醇、葡萄糖、乳糖的混合物添加于球孢白僵菌的孢子懸液后進行干燥處理或田間噴灑，有利于提高白僵菌孢子的存活率或殺蟲率。

本發明的有益效果如下：球孢白僵菌孢子可用于防治茶葉小綠葉蟬，其孢子抗熱性的提高，降低了孢子在制劑制備和保藏過程中的熱損傷，也增加了球孢白僵菌孢子在田間應用時對環境中高溫的抵抗能力，從而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，進而提高其生物防治的效果。

具體實施方式

實施例1：孢子懸浮液以及營養液的制備

孢子懸浮液的制備：

1)洗脫。本發明所用的菌種為球孢白僵菌Beauveria?bassiana(保藏編號為CCTCC?No：M209238)，取適量新鮮發酵培養物于250mL的三角瓶中，加入適量0.05％的吐溫-80溶液和適量玻璃珠，用玻璃棒將培養物搗碎，用振蕩器高速振蕩至少10min。

2)過濾。振蕩后，用2-4層紗布過濾，收集濾液。

3)離心。將濾液離心，條件為：8000r/min、5min、4℃，棄去上清。

4)復溶。將離心后的沉淀物轉移到一50mL離心管中，加入20-40mL?0.05％的吐溫-80溶液和10顆玻璃珠，用振蕩器高速震蕩至少20min。

5)計數。取1mL上述復溶后的孢子懸浮液，用0.05％的吐溫-80溶液稀釋50-100倍后，用血球計數板計數。

6)稀釋。計數后，將原孢子懸浮液用0.05％的吐溫-80溶液稀釋到2×109孢子/mL，待用。

麩皮浸出液(營養液)的制備：