[發(fā)明專利]高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株及用它生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110250427.3
• 申請(qǐng)日: 2011-08-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102703339A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭雄敏;王震;劉倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東恩貝生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P13/10;C12R1/46
• 代理公司: 濟(jì)南誠(chéng)智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株及用它生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

精氨酸脫亞胺酶(Arginine?deiminase，ADI)，是一種能夠分解L-精氨酸的蛋白質(zhì)。學(xué)者們首先從支原體Mycoplasma?arginini提取物中純化得到ADI，研究發(fā)現(xiàn)該酶可以抑制動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)，精氨酸脫亞胺酶不僅能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的體外增殖，還能夠抑制體內(nèi)的惡性腫瘤的增生。精氨酸脫亞胺酶作為一種新型抗腫瘤物質(zhì)，已經(jīng)受到越來(lái)越多研究者的重視。

據(jù)報(bào)道，精氨酸脫亞胺酶能催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-瓜氨酸，該酶促反應(yīng)僅一步，可有效避免L-瓜氨酸全合成途徑中復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)作用，使L-瓜氨酸可以積累到較高的濃度。L-瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，血管舒張作用，穩(wěn)定血壓以及診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，與L-鳥氨酸、L-精氨酸等合用于治療高氨血癥，應(yīng)用前景十分廣闊。由此可見(jiàn)，精氨酸脫亞胺酶作用廣泛，具有非常重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

此前所報(bào)道的精氨酸脫亞胺酶大多來(lái)自于支原體，而支原體是病原微生物，容易引起病害，有較大的危險(xiǎn)性，且支原體為寄生性微生物，培養(yǎng)難度較大，不利于精氨酸脫亞胺酶的發(fā)酵生產(chǎn)。本文中所研究的精氨酸脫亞胺酶生產(chǎn)菌株是糞鏈球菌，該菌株安全性好，易于發(fā)酵制備，有利于精氨酸脫亞胺酶的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。但是目前的研究結(jié)果仍未達(dá)到令人滿意的水平，主要是由于菌種活力較低，難以工業(yè)化應(yīng)用。誘變選育是利用物理或化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞群體，促使其中少數(shù)細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)(主要是DNA)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引發(fā)微生物遺傳性狀發(fā)生變化，然后設(shè)法從群體中篩選出少量?jī)?yōu)良突變菌株的過(guò)程。誘變篩選高產(chǎn)菌株一直是國(guó)內(nèi)外科研工作者在這方面研究的熱點(diǎn)方法。

紫外誘變相對(duì)于其他幾種射線(X射線、β射線、γ射線等)來(lái)說(shuō)最易取材，對(duì)人體的傷害也最小，是最簡(jiǎn)單方便而且又十分有效的一種物理誘變方法。化學(xué)誘變是使用化學(xué)誘變劑與生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生作用，并改變其結(jié)構(gòu)，使其后代發(fā)生變異的一種誘變方法?；瘜W(xué)誘變劑誘發(fā)突變率高，而且染色體畸變較少，對(duì)處理材料損傷輕，有的化學(xué)誘變劑只限于DNA的某些特定部位。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有精氨酸脫亞胺酶生產(chǎn)菌種的缺陷，解決比酶活低的問(wèn)題。本發(fā)明提供一種利用紫外線、硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法對(duì)精氨酸脫亞胺酶生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變育種，篩選得到了一株高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶的突變株，并且對(duì)該突變株進(jìn)行發(fā)酵，利用精氨酸脫亞胺酶能催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化成為L(zhǎng)-瓜氨酸的性質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)新生成L-瓜氨酸的量，來(lái)計(jì)算精氨酸脫亞胺酶的活力，發(fā)現(xiàn)突變株的酶活力有了很大的提高。

本發(fā)明以糞鏈球菌(streptococcus?faecalis)ATCC?10180為出發(fā)菌株，利用紫外線、硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法進(jìn)行誘變育種，篩選得到了一株高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶的突變株，即糞鏈球菌(streptococcus?faecalis)BM-2。該菌株已于2011年06月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC?No.4990。

本發(fā)明糞鏈球菌(streptococcus?faecalis)BM-2?CGMCC?No.4990具有以下微生物學(xué)特性：菌體直徑在0.5-2μm之間，固體培養(yǎng)物主要以雙球菌為主，也有少量呈3-5個(gè)排列的短鏈，液體培養(yǎng)物以長(zhǎng)鏈為主；菌落均為圓形、乳白色，表面微凸?jié)駶?rùn)，邊緣整齊，半透明，直徑1-2mm。

本發(fā)明的糞鏈球菌(streptococcus?faecalis)BM-2CGMCC?No.4990的培養(yǎng)及發(fā)酵：

(1)固體培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基(后者不含瓊脂)由下列重量份的組分組成：

酪蛋白胨5-50份、牛肉膏5-50份、酵母提取物1-30份、葡萄糖1-30份、乙酸鈉1-30份、檸檬酸二銨1-30份、吐溫801-30份、磷酸氫二鉀1-30份、七水硫酸鎂0.1-1份、一水硫酸錳0.01-0.1份、瓊脂10-50份和水1000份；

培養(yǎng)條件：pH?6.0-8.0，培養(yǎng)溫度為25-40℃，培養(yǎng)時(shí)間20-60h。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成(重量份)：葡萄糖5-50份、玉米漿2-50份、蛋白胨5-50份、牛肉膏2-50份、精氨酸2-50份、磷酸二氫鉀1-20份、七水硫酸鎂0.1-1份、氯化鈉1-20份、一水硫酸錳0.01-0.05份和水1000份。