[發(fā)明專(zhuān)利]熒光強(qiáng)度補(bǔ)償方法及熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110249799.4
• 申請(qǐng)日: 2011-08-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102435313A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 酒井啟嗣
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 索尼公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01J3/36
• 分類(lèi)號(hào): G01J3/36
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 余剛;吳孟秋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種熒光強(qiáng)度補(bǔ)償方法及熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置，更具體地，涉及一種用于精確地計(jì)算從微粒上多重標(biāo)記的多種熒光染料的每一種發(fā)出的熒光的強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度控制方法。

背景技術(shù)

為了測(cè)量諸如細(xì)胞的微粒的特性，現(xiàn)有裝置(如流式細(xì)胞儀)使用熒光染料標(biāo)記微粒、向熒光染料照射激光束以激發(fā)熒光染料以及測(cè)量由激發(fā)的熒光染料發(fā)出的熒光的強(qiáng)度或圖譜(pattern)。近年來(lái)，為了更精確地分析例如細(xì)胞的特性，使用其中用多種熒光染料標(biāo)記微粒并使用具有不同接收光波段的多個(gè)光檢測(cè)器(如PD(光電二極管)或PMT(光電倍增管)測(cè)量從熒光染料發(fā)出的激光束的多色法測(cè)量。在多色法測(cè)量中，為了檢測(cè)熒光，根據(jù)所使用的熒光染料的熒光波長(zhǎng)為光檢測(cè)器選取一個(gè)濾光片。

然而，當(dāng)前使用的熒光染料(如FITC(異硫氰酸熒光素))或PE(藻紅蛋白)在熒光光譜中具有重疊的頻段。因此，在使用這些熒光染料的組合進(jìn)行多色法測(cè)量的情況下，即使使用濾光片將從各熒光染料發(fā)出的熒光分離為不同的頻段，光檢測(cè)器仍可檢測(cè)到從不想要的熒光染料中漏入(spillover)的熒光。如果發(fā)生熒光漏入，則光檢測(cè)器檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度偏離從期望的熒光染料發(fā)出的熒光的真實(shí)強(qiáng)度。因此，產(chǎn)生測(cè)量誤差。

為了補(bǔ)償測(cè)量誤差，通過(guò)從由光檢測(cè)器測(cè)出的熒光強(qiáng)度減去漏入的熒光的強(qiáng)度來(lái)執(zhí)行熒光補(bǔ)償。通過(guò)以電的方式或數(shù)學(xué)的方式補(bǔ)償脈沖來(lái)執(zhí)行熒光補(bǔ)償，使得由光檢測(cè)器測(cè)出的熒光強(qiáng)度變?yōu)槠谕麩晒獾恼鎸?shí)熒光強(qiáng)度。

一種以數(shù)學(xué)方式補(bǔ)償熒光強(qiáng)度的方法，是通過(guò)將由光檢測(cè)器測(cè)出的熒光強(qiáng)度(檢測(cè)值)定義為向量并將預(yù)定的漏入矩陣的逆矩陣作用于該向量來(lái)執(zhí)行。以此方式，可算出從期望的熒光染料發(fā)出的熒光的真實(shí)強(qiáng)度(參照?qǐng)D3和圖4，及日本未審查專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2003-83894號(hào))。通過(guò)分析被單標(biāo)記的各微粒的熒光波長(zhǎng)分布來(lái)生成漏入矩陣。在漏入矩陣中，各熒光染料的熒光波長(zhǎng)分布被表示為列向量，并對(duì)這些列向量進(jìn)行排列。漏入矩陣的逆矩陣也被稱(chēng)作“補(bǔ)償矩陣”。在圖3和圖4中，示出了使用五種熒光染料(FITC、PE、ECD、PC5和PC7)和五個(gè)光檢測(cè)器進(jìn)行五色法測(cè)量的示例。

發(fā)明內(nèi)容

在使用補(bǔ)償矩陣對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行補(bǔ)償?shù)姆椒ㄖ校试S負(fù)值用作矩陣的元素。因此，補(bǔ)償?shù)臒晒鈴?qiáng)度可以為負(fù)。這是因?yàn)榘诟鞴鈾z測(cè)器的檢測(cè)值中的噪聲會(huì)影響矩陣元素的值。然而，實(shí)際上，從各熒光染料發(fā)出的熒光的強(qiáng)度不為負(fù)。此外，如果從一種熒光染料發(fā)出的熒光的強(qiáng)度被計(jì)算為負(fù)值，則從其它熒光染料發(fā)出的熒光的強(qiáng)度的計(jì)算值在正方向上出現(xiàn)誤差。

如果在要分析的微粒群中存在一種熒光染料的熒光強(qiáng)度為負(fù)的子群，則在二維相關(guān)圖(細(xì)胞直方圖)中不繪出該子群，其中在二維相關(guān)圖中熒光染料的熒光強(qiáng)度標(biāo)繪在對(duì)數(shù)軸上(具有對(duì)數(shù)尺度)。因此，用戶(hù)可能誤解二維相關(guān)圖上標(biāo)繪的群少于實(shí)際的群。

此外，在現(xiàn)有的熒光強(qiáng)度補(bǔ)償方法中，在將從微粒發(fā)出的自身熒光的強(qiáng)度的檢測(cè)值當(dāng)作背景值并從各光檢測(cè)器的檢測(cè)值中減去自身熒光的強(qiáng)度時(shí)，將整個(gè)群的自身熒光強(qiáng)度的平均值用于計(jì)算。然而，子群與子群間的自身熒光的強(qiáng)度和圖譜是不同的。因此，從所有群的每一個(gè)中減去相同平均值的計(jì)算引起熒光強(qiáng)度的計(jì)算值誤差。具體地，如果要分析的子群間的自身熒光差異顯著，則誤差增加。

因此，本發(fā)明提供了一種在使用多個(gè)光檢測(cè)器對(duì)用多種熒光染料多重標(biāo)記的微粒進(jìn)行多色法測(cè)量時(shí)，精確地計(jì)算從各熒光染料發(fā)出的熒光的強(qiáng)度并向用戶(hù)呈現(xiàn)算得的強(qiáng)度的技術(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，一種熒光強(qiáng)度補(bǔ)償方法包括：向用熒光波段彼此重疊的多種熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光、激發(fā)熒光染料并使用具有不同接收波段的光檢測(cè)器接收由激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的熒光；以及通過(guò)在對(duì)算得的熒光強(qiáng)度賦予預(yù)定限制條件下補(bǔ)償所述光檢測(cè)器的檢測(cè)值來(lái)計(jì)算所述熒光染料的熒光強(qiáng)度。

在計(jì)算熒光強(qiáng)度過(guò)程中，可通過(guò)使用從標(biāo)記有一種熒光染料的微粒獲得的單染色光譜和從未標(biāo)記任何一種熒光染料的微粒獲得的自身熒光光譜的線(xiàn)性和對(duì)測(cè)量光譜進(jìn)行近似來(lái)計(jì)算各熒光染料的熒光強(qiáng)度和自身熒光強(qiáng)度，該測(cè)量光譜是通過(guò)收集各光檢測(cè)器的檢測(cè)值所獲得的。通過(guò)在考慮微粒自身熒光成分時(shí)執(zhí)行計(jì)算，可精確地計(jì)算子群間相互不同的自身熒光成分，因此，可避免由子群之間的自身熒光強(qiáng)度不同引起的測(cè)量誤差。