[發(fā)明專利]一種在里氏木霉分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110249476.5
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102304540A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王瑋;魏東芝;呂丹丹
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/21;C12N1/15;C12P21/02;C12N9/00;A23K1/16;A61K38/00;C12R1/885;C12R1/01
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種一種在里氏木霉(Trichoderma?reesei)分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

里氏木霉是在二戰(zhàn)時期從所羅門群島的棉制油布中分離得到的一種嗜溫腐生性絲狀真菌，具有良好的降解纖維素材料的能力。由于該菌由Reese?E.T.博士篩選鑒定，因此被命名為Trichoderma?reesei。作為工業(yè)菌株，T.reesei能夠生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶等，其中一些里氏木霉突變株的胞外酶蛋白產(chǎn)量可達(dá)60g/L，而最主要的纖維素酶CBHI(cellobiohydrolase?I，纖維二糖水解酶I)、CBHII(cellobiohydrolase?II，纖維二糖水解酶II)，分別可以達(dá)蛋白分泌總量的50％(約30g/L)和40％(約24g/L)。里氏木霉作為工業(yè)生產(chǎn)菌株生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶已有多年的歷史，這些酶類被廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、制漿等工業(yè)領(lǐng)域。除具有極好的合成和分泌蛋白的能力以外，T.reesei還具有真核的蛋白分泌機制和與哺乳動物系統(tǒng)相似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾、加工性能，如高甘露糖型和N-糖基化。由于其適于蛋白生產(chǎn)的諸多優(yōu)點，而且對人類沒有毒性，里氏木霉也已成為相關(guān)研究人員開展真菌細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和生理生化研究的重要生物材料。美國能源部(NOE)資助支持了里氏木霉基因組的測序工作，目前全基因組序列已經(jīng)完成并公布。里氏木霉全基因組測序的完成為利用功能基因組學(xué)方法研究具有重要生物學(xué)意義的功能基因奠定了基礎(chǔ)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA將外源基因轉(zhuǎn)移到真菌基因組中的方法。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化是近年來發(fā)展的一種新方法，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比，該方法操作簡便，可導(dǎo)入大片段的DNA，轉(zhuǎn)化效率高，導(dǎo)入基因大多是單拷貝，表達(dá)效果好，穩(wěn)定遺傳。基于上述優(yōu)點，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為目前真菌分子生物學(xué)研究中快速發(fā)展的轉(zhuǎn)化方法，成為真菌系統(tǒng)突變分析的有效工具。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對外源蛋白表達(dá)量低，分離純化困難的不足，提供一種操作簡便快捷的用于在里氏木霉(Trichoderma?reesei)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其應(yīng)用和所獲得的里氏木霉基因工程菌，可高效分泌表達(dá)來源于動物、植物和真菌等的異源基因。

本發(fā)明的第一方面提供一種用于在里氏木霉(Trichoderma?reesei)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備，其中，所述的表達(dá)設(shè)備從5’至3’依次包括以下元件：(1)控制外源基因在里氏木霉中轉(zhuǎn)錄的里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶II啟動子(P_cbhII)；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表達(dá)的信號肽的編碼序列；(3)多克隆位點序列；(4)控制外源基因在里氏木霉中終止轉(zhuǎn)錄的里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶II終止子。

本發(fā)明中，所述的啟動子是能夠控制外源基因在里氏木霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子，較佳的為里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶II啟動子(P_cbhII)，更佳的啟動子的序列是序列表中SEQ?ID?NO：1的第7位至第980位所示。

本發(fā)明中，所述的信號肽可以是本領(lǐng)域中能夠控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表達(dá)的任何信號肽(分泌肽)，較佳的信號肽的編碼序列為序列表中SEQ?ID?NO：1第981位至第1043位所示。

本發(fā)明中，所述的多克隆位點可以是本領(lǐng)域各種常規(guī)的多克隆位點，較佳的多克隆位點序列是序列表中SEQ?ID?NO：2所示。

本發(fā)明中，所述的終止子是能夠控制外源基因在里氏木霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子(T_cbhII)，較佳的是里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶II終止子，更佳的終止子的序列是序列表中SEQ?ID?NO：1的第1074位至第2169位所示。

較佳的，所述的表達(dá)設(shè)備還包括以下元件：(5)篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒，其位于元件(1)啟動子的上游或元件(4)終止子的下游。

本發(fā)明中，所述的篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒能夠在里氏木霉中表達(dá)各種本領(lǐng)域的常規(guī)篩選標(biāo)記，較佳的，所述的篩選標(biāo)記是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、慶大霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，較佳的篩選標(biāo)記是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其基因序列較佳的是GeneBank的登錄號為Z32698.1的第1437位至第4057位所示。

本發(fā)明所述的表達(dá)設(shè)備最優(yōu)選的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示。