[發明專利]UNG-dUTP防產物污染系統在全血PCR反應體系的應用

無效

• 申請號: 201110248886.8
• 申請日: 2011-08-28
• 公開（公告）號: CN102321611A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 何曉輝;王進;秦正紅
• 申請（專利權）人: 蘇州曠遠生物分子技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明涉及分子生物技術中的PCR擴增技術領域，尤其涉及UNG-dUTP防產物污染系統在全血PCR反應體系的應用。?

背景技術

PCR（Polymerase?Chain?Reaction），即聚合酶鏈式反應，是一種體外擴增DNA片段的技術。1985年，美國科學家Kary?Mullis發明了PCR技術。采用PCR擴增方法，在反應體系中即使只有一個拷貝DNA片段，在經過變性退火延伸等溫度變化循環之后，就能擴增出大量拷貝數的特異性DNA片段。該方法廣泛應用于生命科學研究與臨床基因檢測。

PCR的原理是在體外緩沖體系內模仿細胞內發生的DNA復制過程，以DNA互補鏈聚合反應為基礎，通過目的模板DNA變性、引物與模板DNA的互補配對序列退火復性以及耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸反應等過程的多次循環，產生特異性擴增的DNA片段。經過多循環的擴增后，特異性DNA片段的量達到檢測靈敏度的要求，便于進行后續的凝膠電泳或者熒光定量分析。

由于PCR具有非常高的擴增效率和靈敏度，極其微量的DNA污染便可造成假陽性的結果。污染的主要原因有以下兩種情況：(1)?樣本間交叉污染:?樣本污染主要發生原因為收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，而造成交叉污染;?另外，樣本在核酸的提取過程中，由于移液器操作不當引起樣本間交叉污染；?(2)?PCR擴增產物污染：PCR產物是PCR反應中最為常見的污染來源，?PCR產物的拷貝數量非常大，一般為10¹³拷貝/ml，極微量的PCR產物污染，就可造成假陽性結果.?造成PCR產物污染的形式最可能是氣溶膠污染，PCR反應體系在反應管開蓋、搖動、快速吸樣、反復吹吸等操作時與空氣接觸都可很容易形成氣溶膠，據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，可見微量的氣溶膠污染即可引起假陽性結果.?而且氣溶膠可在試劑配制過程中污染PCR試劑，造成嚴重的產物污染現象。

目前，在臨床上常見的檢測樣本是人外周靜脈血液，無論是對血液中基因組DNA進行提取然后進行PCR還是使用全血為模板直接進行PCR反應，均存在PCR產物氣溶膠污染的問題。

UNG-dUTP系統是在PCR污染引起假陽性結果的問題出現不久便被發明的用于防產物污染的方法，并在美國申請了專利（US?5536649）。該方法具有可徹底消除污染源的優點，UNG?(Uracil-DNA?Glycosylase,?尿嘧啶DNA糖基化酶)處理可以和PCR在同一個反應管內進行，具有簡便性。其技術原理是：在PCR反應體系內加入dUTP代替dTTP或者按照一定比例同時加入dUTP和dTTP，使PCR反應產物中摻入大量的dUTP（也可以采用含有dUTP的引物進行擴增的方法），在再次PCR之前用UNG處理PCR反應體系即可消除上一次PCR產物（dU-DNA）的殘留污染。UNG在一定溫度條件下，可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，除去上一次PCR產物雙鏈上的dUTP，阻止了DNA聚合酶對dU-DNA為模板進行延伸，而UNG對不含dUTP的模板的擴增無任何影響。特別的，?UNG在PCR循環中的變性步驟中經高溫被滅活，因此也不會影響新一輪PCR產物dU-DNA的生成。

專利CN1940087A公開了UNG-dUTP系統用于血清或血漿標本病毒核酸的測定，文中描述的方法需要先對血液中基因組DNA進行提取然后再將UNG-dUTP系統用于PCR反應，由于血液中基因組DNA的提取過程比較繁瑣，也無法避免樣本間交叉污染。該法沒有直接用于全血為模板的PCR系統，UNG-dUTP系統仍是應用于提取后的DNA擴增體系。

全血模板中存在復雜的組分，含有多種酶類，糖類，脂類，以及各種酶的抑制因子，全血的加入使PCR反應體系環境不同于提取DNA后的反應體系，目前尚無文獻報道UNG-dUTP系統可以適用于全血為模板的PCR體系。

發明內容

本發明提供一種UNG-dUTP防產物污染系統在全血PCR反應體系的應用，目的是解決現有以全血為模板進行PCR反應體系容易產生PCR產物氣溶膠污染的問題。UNG和dUTP或者UNG和含有dUTP的引物等組分同時直接加入以全血為模板進行PCR反應體系，能夠有效的消除了由于PCR產物氣溶膠污染導致的假陽性結果。

本發明通過以下技術方案來達到全血PCR反應體系防產物污染的目的。