[發(fā)明專利]一種莽草酸生產(chǎn)用基因工程菌株的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110248675.4
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102304539A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王春陽;張?zhí)N才;武廣君;孟軍虎;任存邦;董建輝;石玲瓏;李曉霞;喬娟平;葉曉沖;王娜
• 申請（專利權(quán)）人: 河南孟成生物藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

1.一種莽草酸生產(chǎn)用基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

①構(gòu)建aroA基因敲除的大腸桿菌菌株；②構(gòu)建含有莽草酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因aroG^FBR、aroE、aroB、aroD、tktA和ppsA的重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63；③將重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63轉(zhuǎn)入已敲除aroA基因的大腸桿菌菌株，獲得表達(dá)莽草酸的生產(chǎn)菌株。

2.如權(quán)利要求1所述莽草酸生產(chǎn)用基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟①包括：a、通過PCR擴增獲得aroA同源替換序列DaroA；

b、將質(zhì)粒pKD46導(dǎo)入大腸桿菌菌株W3110；

c、誘導(dǎo)步驟b所得陽性菌株產(chǎn)生同源重組所需的酶，收獲菌體制備感受態(tài)細(xì)胞；

d、通過電擊轉(zhuǎn)化將步驟a獲得的同源替換序列DaroA導(dǎo)入步驟c獲得的感受態(tài)細(xì)胞，得到aroA基因被替換的菌株；

e、使用pCP20質(zhì)粒消除步驟d所得菌株的抗性基因片段，得到aroA基因敲除菌株。

3.如權(quán)利要求1所述莽草酸生產(chǎn)用基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟②包括：?

a、基于質(zhì)粒pACYC184構(gòu)建包含trpR基因的改造載體pAR；

b、構(gòu)建抗反饋抑制的aroG^FBR基因，并在基因前加上色氨酸啟動子P_trp；

c、克隆aroB和aroE基因，并為其添加核糖體結(jié)合位點RBS；

d、克隆基因tktA、ppsA和aroD，并在tktA前加上色氨酸啟動子P_trp，在ppsA后面加上轉(zhuǎn)錄終止子；

e、將各基因按照P_trp、aroG^FBR、aroE、aroB、aroD、P_trp、tktA、ppsA和轉(zhuǎn)錄終止子的順序連接至pAR質(zhì)粒，構(gòu)成pAR63質(zhì)粒。

4.如權(quán)利要求3所述莽草酸生產(chǎn)用基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63中含有色氨酸啟動子阻遏蛋白基因trpR，且trpR帶有自身啟動子。

5.如權(quán)利要求3所述莽草酸生產(chǎn)用基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63中所含的ppsA基因下游序列為轉(zhuǎn)錄終止子序列；所述重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63中所含的tktA基因上游序列為色氨酸啟動子序列；所述重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63中所含的aroB和aroE基因上游序列均含有RBS序列；所述重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63中所含的aroD基因帶有自身RBS序列；所述重組表達(dá)質(zhì)粒pAR63中所含的aroG^FBR基因上游序列為色氨酸啟動子序列，aroG^FBR是由aroG基因的180位點定點突變?yōu)镻he而獲得。

6.如權(quán)利要求5所述莽草酸生產(chǎn)用基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄終止子序列為rrnB轉(zhuǎn)錄終止子序列。