[發(fā)明專利]副溶血弧菌免疫金快速檢測試紙的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110248547.X
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102393455A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孔繁德;徐淑菲;劉陽;陳信忠;龔艷清;楊俊萍;郭樹林
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 廈門市誠得知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 35209
• 代理人: 方惠春

1.副溶血弧菌免疫金快速檢測試紙的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

a）副溶血弧菌抗原的制備：用蛋白胨水培養(yǎng)基將副溶血弧菌培養(yǎng)過夜；

b）制得副溶血弧菌滅活疫苗；

c）用疫苗免疫實驗兔制備多價抗血清：采用皮下多點注射和靜脈直接注射免疫兔子制備兔抗副溶血弧菌多抗抗體，分別得到皮下多點注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體和靜脈直接注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體;

d）抗血清純化；

e）膠體金標記：將純化的皮下多點注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體用膠體金進行標記；

f）免疫金試紙條的制備：先將步驟d）中純化的靜脈直接注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在微孔濾膜檢測線上，羊抗兔抗體噴在對照線上，再將步驟e）中制備的膠體金標記的皮下多點注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在玻璃纖維膜上，然后組裝成免疫金試紙條。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述的步驟b），制得副溶血弧菌滅活疫苗，具體為：先經(jīng)過0.3%的甲醛37℃滅活24h，然后經(jīng)培養(yǎng)檢測確實無活菌后作為抗原。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述的步驟c），用疫苗免疫實驗兔制備多價抗血清,采用皮下多點注射和靜脈直接注射免疫兔子制備兔抗副溶血弧菌多抗抗體，具體為：

1）靜脈注射免疫：每10天注射一次，首次1mL，第二次1.5mL，第三次2mL，第四次3mL，當效價達到1：1280或1：2560時放血；

2）弗氏佐劑皮下多點注射免疫：弗氏完全佐劑與菌液等體積混合后，兔頸背部皮下多點注射4mL，2周后，用弗氏不完全佐劑與菌液等體積混合液頸背部皮下多點注射4mL，2周后，采血前5-7天靜脈注射4mL，當效價達到1：1280或1：2560時放血。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述的步驟f），免疫金試紙條的制備,具體為：

用膠體金標記皮下多點注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體，建立膠體金免疫層析快速檢測副溶血弧菌的方法；應用微孔濾膜作載體的免疫檢測，先將靜脈直接注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在微孔濾膜檢測線上，羊抗兔抗體噴在對照線上，膠體金標記的皮下多點注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在玻璃纖維膜上，干燥后加入封閉液于微孔濾膜上，烘干液體后組裝成檢測副溶血弧菌試紙；再通過金顆粒放大免疫反應系統(tǒng)，使反應結(jié)果在固相載體微孔濾膜上顯示出來。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述封閉液配方采用：含有1%（W/V）酪蛋白和0.05%（V/V）Tween?-20的濃度為0.01?mol/L的PBS溶液，PBS溶液的pH值為7.2。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測試紙的制備方法，其特征在于，所制備的免疫金快速檢測試紙用于現(xiàn)場檢測時，將試紙條平放在桌面上，在加樣端加上100uL的樣品，樣品首先溶解噴在玻璃纖維膜上的金標兔抗副溶血弧菌抗體，然后溶液往微孔濾膜移動，當遇到檢測線的兔抗副溶血弧菌抗體時，判斷試紙檢測結(jié)果的標準如下：

樣品中含有副溶血弧菌：在檢測線和對照線上均顯現(xiàn)一條紫紅色線；

樣品中不含有副溶血弧菌：只在對照線上出現(xiàn)一條紫紅色線；

試紙無效：檢測線和對照線上均不出現(xiàn)一條紫紅色線。