[發明專利]轉基因玉米品系MON89034 PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201110248329.6
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102952862A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 章桂明;向才玉;凌杏園;潘廣;程穎慧;康林;李鶴遙
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

技術領域

本發明涉及一種轉基因產品的檢測，特別是涉及一種轉基因玉米品系的PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法。?

背景技術

目前對轉基因玉米的檢測方法主要采用常規PCR，實時熒光PCR、PCR-基因芯片等檢測方法。傳統的常規PCR檢測方法在平臺擴展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標的增加，需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進行優化，并且兼顧擴增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴增產物的方法，區分效率不高，檢測結果不理想。實時熒光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較多重常規PCR檢測方法有優勢，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時提供互不干擾的4個熒光通道，也限制了該技術在檢測通量擴展，并且檢測成本高。常規的多套PCR-基因芯片檢測方法，需要多套引物進行擴增，操作步驟繁瑣，并不適合大規模的高通量檢測。變性高效液相色譜技術(Denaturing?High-performance?Liquid?Chromatography，DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有分辨率好、擴展性強、靈敏度高等優點。該方法在50℃條件分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對的數量決定洗脫順序，當過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會根據分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與marker比較確定分子量大小，判定是否含有目標檢測基因。目前，尚沒有轉基因玉米品系MON89034的PCR結合DHPLC的檢測技術(PCR-DHPLC)。?

發明內容

本發明的目的是提供一種用于轉基因玉米品系MON89034的PCR-DHPLC檢測的引物。?

本發明的另一目的是提供一種基于上述引物的擴展性能好、靈敏度和分辨率高的轉基因玉米品系MON89034的PCR-DHPLC檢測方法。?

為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：?

本發明公開了用于轉基因玉米品系MON89034的PCR-DHPLC檢測的引物，所述引物的上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.2所?示序列；?

Seq?ID?No.1：5’-TTTTTCTCCATATTGACCATCATACTC-3’?

Seq?ID?No.2：5’-ATATAGATGGACGGTTTAGATTGGC-3’。?

需要指出的是，上述Seq?ID?No.1和Seq?ID?No.2是與轉基因玉米品系MON89034的檢測靶標序列互補配對的特異序列，具有很強的特異性識別性。?

進一步的，所述上游引物的5’端還包括Seq?ID?No.3所示序列，所述下游引物的5’端還包括Seq?ID?No.4所示序列；?

Seq?ID?No.3：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’?

Seq?ID?No.4：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3’。?

需要指出的是，上述Seq?ID?No.3和Seq?ID?No.4是分別在上游引物和下游引物的5’端添加的與檢測靶標序列無關的一段序列，該序列可以是與檢測靶標序列同源性很遠的其它物種的序列，也可以是一段隨機生成的序列。該序列可以用于調控PCR擴增產物的大小，以便于PCR擴增產物的進一步分析。?

本發明中，優選的，所述上游引物具有Seq?ID?No.5所示序列，下游引物具有Seq?ID?No.6所示序列；?

Seq?ID?No.5：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTTTTTCTCCATATTGACCATCATACTC-3’?

Seq?ID?No.6：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAATATAGATGGACGGTTTAGATTGGC-3’。?

需要說明的是，所述Seq?ID?No.5和Seq?ID?No.6序列是由上述Seq?ID?No.1和Seq?ID?No.2序列分別在其5’端添加調控序列而成，盡管上述已經說明Seq?ID?No.3和Seq?ID?No.4所示調控序列可以是隨機生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具體到本發明中，需要考慮調控序列與Seq?ID?No.1和Seq?ID?No.2所示序列的理化性質的統一協調，并且還需要考慮添加調控序列后的Seq?ID?No.3和Seq?ID?No.4所示序列作為檢測引物的整體性能。?