[發明專利]一種產堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201110247289.3
• 申請日: 2011-08-24
• 公開（公告）號: CN102311934A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉龍;李江華;楊海泉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/28;D06M16/00;C12S11/00;C11D3/386;C11D7/42;C12R1/07
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一株產堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌及其應用。

背景技術

α-淀粉酶（EC?3.2.1.1）是一種降解淀粉的重要的工業用酶，主要應用在食品、紡織、醫藥、洗滌劑等領域。堿性淀粉酶最適反應pH應高于8.0，堿性淀粉酶可用于紡織品退漿、洗滌劑添加劑以及以淀粉作粘結劑的粘度調節劑等。Horikoshi在1971年首先報道了產自嗜堿菌A-40-2的堿性淀粉酶。2007年Saxena等人篩選到一株可以產堿性淀粉酶的菌株。2010年Pancha等人篩選出一株產耐溫淀粉酶菌株。四川大學盧濤等人從西藏當雄八宿溫泉土壤中篩選出一株分泌高溫淀粉酶的高產突變菌株，為地衣芽孢桿菌，該菌生長的地理環境獨特，其高溫特性良好，經改造得到了一種pH活性域較寬、熱穩定性較高的淀粉酶。目前，國內的前處理酶制劑市場基本被丹麥諾維信公司和美國杰能科公司所壟斷。諾維信公司介紹了一種堿性淀粉酶，有較寬的pH及溫度范圍。目前國內外工業化的堿性淀粉酶幾乎沒有，因此篩選產堿性淀粉酶的優良菌株非常有必要。

發明內容

本發明提供了一種嗜堿芽孢桿菌JN21（Bacillusalcalophilus?JN21），已于2011年7月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M?2011229，地址：中國武漢、武漢大學；其16SrDNA序列如核苷酸序列表中SEQ?ID?NO:1所示，以其16SrDNA全序列為基礎的系統發育樹如說明書附圖2所示。

本發明還提供了一種堿性淀粉酶，來源于嗜堿芽孢桿菌JN21，CCTCC?NO：M?2011229，其最適反應pH為10.5。

所述產堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌是從堿性土壤中篩選，其保藏條件如下：從生長良好的平板上接取3環嗜堿芽孢桿菌到搖瓶培養基中，30℃搖床（200?rpm）培養36?h，取0.65?mL移入含有0.3?mL無菌甘油的甘油管中，放入-70℃超低溫冰箱保存。

所述固態平板培養基為：1.0%?玉米淀粉，0.5%?酵母粉，1.5%?蛋白胨，0.5%?NaCl，0.05%?KH₂PO₄，2%?瓊脂粉，滅菌后，用Na₂CO₃?調pH?9.5-10.5。

所述液體發酵培養基為：1.5%?可溶性淀粉，1.0%?酵母粉，1.0%?蛋白胨，0.5%?NaCl，0.05%?KH₂PO₄，滅菌后，用Na₂CO₃?調pH?9.5-10.5。

所述嗜堿芽孢桿菌的培養條件為：將已保藏甘油管的嗜堿芽孢桿菌接入液體發酵培養基，30℃，200?rpm，搖床培養36?h。

將產堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌發酵后的發酵液，10000?rpm?離心10?min，在pH?10.0條件下，采用DNS法測定離心后發酵上清液的堿性淀粉酶酶的酶活。在堿性條件下，酶活明顯。在不同堿性pH值下，測定堿性淀粉酶的最適反應pH，堿性淀粉酶的最適反應pH為10.5，在堿性環境下，可以高效降解淀粉。

本發明自堿性土壤中篩選出一株產堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌JN21（Bacillusalcalophilus?JN21），該菌株可生產耐強堿的堿性淀粉酶，該堿性淀粉酶可以在強堿的環境下高效降解淀粉。將菌株生產的堿性淀粉酶應用于紡織退漿、洗滌劑添加、醫藥、食品等領域，可以在堿性環境下高效降解淀粉，達到所需的目的。

附圖說明

圖1：采用含有玉米淀粉的固體培養基平板篩選產堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌;

圖2：嗜堿芽孢桿菌（Alkaliphilic?bacillus?sp.）JN21的系統發育樹;

圖3：嗜堿芽孢桿菌產生的堿性淀粉酶的最適反應Ph;

圖4：嗜堿芽孢桿菌產生的堿性淀粉酶的最適穩定pH。

具體實施方式

實施例1：產堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌篩選方法

取采取的一定量堿性土壤，放入裝有100?mL無菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩，稀釋不同濃度梯度，將不同濃度梯度稀釋好的樣品分別涂布到含有玉米淀粉的pH值為10.0的固體培養基平板上，30℃培養36?h。反復進行平板劃線分離，重復三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。