[發明專利]固定化漆酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201110247183.3
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102286455A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 湯琳;劉媛媛;曾光明;龐婭;雷曉霞;伍夢詩;李貞;危臻
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C01B31/02
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術領域

本發明涉及酶的固定化領域，具體涉及一種固定化漆酶及其制備方法。

背景技術

漆酶(laccase，E.C.1.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于真菌、細菌和植物中。漆酶具有較廣泛的底物專一性和較強的穩定性，能催化許多酚類和芳香胺類物質，如苯酚、對氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺類物質，因而在生物傳感器、生物燃料電池、生物轉化及廢水處理等領域具有廣泛應用。但由于漆酶易溶于水，在水中游離的漆酶不可回收也不能長期保存，且在高溫或其他極端環境下漆酶的穩定性不易保持，因而限制了漆酶的實際應用。固定化技術在保持游離漆酶的專一、高效的催化活性的同時，更是提高漆酶重復利用性、操控性和穩定性的有效手段，常用的固定化載體包括活性炭、殼聚糖、多孔硅膠以及微濾膜等多種材料，但現有的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復雜、分離困難以及操作性不高等缺陷。

新型介孔材料由于具有納米規整的有序孔道結構、巨大的比表面積及孔容等特征，在生物催化和分離領域，尤其是在作為酶固定化載體的研究和應用上顯示了極大潛力。有文獻報道，用大孔徑的磁性介孔硅固定漆酶，固定化酶的活性回收率較高，且提高了漆酶的pH穩定性和熱穩定性(Yufang?Zhu?et?al，Chemistry?of?Materials，2007，6408-6413)，但該類介孔材料具有制備過程繁瑣、難以分離等缺點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：針對現有技術的不足，提供一種具有大比表面積和二級介孔結構的磁性介孔碳材料固定的且具有優異酶學性能的固定化漆酶，以及相應提供該固定化漆酶的制備方法。

為解決上述問題，本發明采用以下技術方案：一種固定化漆酶，其以磁性介孔碳為載體，漆酶通過物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道內嵌入有磁性納米顆粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率為60％～95％(優選的技術方案可達75％～95％)。

作為對上述的固定化漆酶的優化，所述的磁性介孔碳與漆酶的質量配比為1∶(1～2.5)。

作為對上述的固定化漆酶的優化，所述磁性介孔碳含有有序雙峰介孔結構。優選的，該有序雙峰介孔結構是指磁性介孔碳孔徑分布的兩個峰值分別出現在4nm附近區域和18nm附近區域。4nm附近區域特別是指孔徑主要集中分布在4nm～5nm的孔徑范圍內，18nm附近區域特別是指孔徑主要集中分布在14nm～18nm的孔徑范圍內。

作為一個總的發明構思，本發明還提供上述的固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：先準備磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始濃度為0.3mg/ml～1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值為3.0～6.0；然后將磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中，在25℃～30℃的溫度下對混合溶液振蕩3h以上；再經過洗滌、磁性分離、冷凍和真空干燥后，得到固定化漆酶。

上述的制備方法中，優選地，所述漆酶溶液是由漆酶與檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液配制而成，所述檸檬酸緩沖液的pH值為3.5～4.0，所述磷酸緩沖液的pH值為4.5～5.5。

作為對上述的制備方法的優化，所述振蕩的轉速為100rpm～120rpm，所述振蕩的時間為3h～7h。

作為對上述的制備方法的優化，所述磁性介孔碳通過以下方法制得：

(1)先將嵌段共聚物(模板劑)與正硅酸乙酯在30℃～35℃的溫度下混合攪拌20h～24h，再將混合液轉移至135℃～140℃下水熱反應22h～24h，得到白色沉淀，將所述白色沉淀洗滌至中性后過濾、干燥，得到白色粉末；

(2)將上述得到的白色粉末在500℃～550℃的溫度下煅燒4h～5h后(模板劑嵌段共聚物被脫除)得到介孔硅模板；

(3)利用初濕浸漬法將由金屬硝酸鹽、乙醇和糠醇組成的多元溶液滲透到所述介孔硅模板中，然后在70℃～80℃的空氣中對滲透有多元溶液的介孔硅模板固化10h～12h，干燥后得到復合物；

(4)將所述步驟(3)得到的復合物在N₂中于800℃～900℃的溫度下熱處理1h～2h，然后用加熱至80℃～90℃的氫氧化鈉溶液洗滌移除復合物中的硅模板，再對移除硅模板后的復合物過濾、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。

上述的制備方法中，優選地，所述金屬硝酸鹽是指摩爾比為1∶(1～11)的Fe(NO₃)₃與Ni(NO₃)₂的混合物。